[發明專利]一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基和使用方法

在審

• 申請號: 201710018241.2
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106635961A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 聶蘇秦
• 申請（專利權）人: 陜西九州生物醫藥科技集團有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司11335
• 代理人: 吳甘棠

1.一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于，包括：

(1)基礎培養基：H-DMEM或者DMEM-F12；

(2)添加組分：維生素C 50-100μg/ml，表皮細胞生長因子(EGF)3-20ng/ml；

(3)血清5-15％。

2.根據權利要求1所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：

還包括：(4)dispase II(麥約爾CEL078)；

(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)；

(6)0.25％胰蛋白酶；

(7)皮膚保存液。

3.根據權利要求1所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：其中，(1)基礎培養基為H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；

無菌的干粉、液體狀態。

4.根據權利要求3所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：基礎培養基的配置方法是向基礎培養基粉末(H-DMEM)，加入無菌超純水一部分，進行先溶解，然后根據培養基說明書規定的體積進行定容；

充分溶解后，0.22微米濾膜進行過濾、封裝；

然后按照需求，在基礎培養液中加入5％-15％的血清。

5.根據權利要求3所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：基礎培養基的配置方法是液體DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混勻即可，用HCL或者NaOH調整pH為7.0-7.5。

6.根據權利要求1所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：其中，(2)添加組分按照培養基的終體積，配置。

7.根據權利要求1所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：其中，(3)血清的選自動物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自體血清(臨床使用)，血清的濃度5-15％；

提供狀態：無菌、補體滅活

自體血清的制備：

1)血清分離：將血樣進行分離；

2)過濾除菌：將步驟1)得到的樣品0.22微米過濾器進行兩次過濾；

3)血清滅活：將步驟2)得到的樣品56℃水浴滅活熱原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；

4)紫外線照射：有時，在步驟3)獲得的樣品在使用或者封裝前要紫外線照射。

8.根據權利要求2所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：(4)dispase II(麥約爾CEL078)配制，用電子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至1.5-2.4U/ml的工作液。

9.根據權利要求2所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)配制，用電子天平秤取1g的IV型膠原酶粉末，用100ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至30-50U/ml的工作液。

10.根據權利要求2所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：(6)0.25％胰蛋白酶配制，0.25mg的膠原酶溶解到100ml0.9％生理鹽水中，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；分裝置于5ml離心管中，放置在-20℃凍存。

11.根據權利要求2所述的一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于：(7)皮膚保存液的配制，將醫用青霉素和鏈霉素配制成100ug/ml，在98ml的0.9％生理鹽水中加入1ml的青霉素和鏈霉素。

12.一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1.人皮膚成纖維細胞原代培養

1.1雙眼皮手術中切除的皮膚組織，放置在皮膚保存液中(生理鹽水+雙抗)運至GMP實驗室，用含青鏈霉素的生理鹽水沖洗3次；

1.2在皮膚組織中加入dispase II，其濃度為30-50U/ml，37℃消化30分鐘，然后在超凈工作臺內用眼科剪和眼科鑷將皮膚的表皮和皮下組織小心剝離，用生理鹽水將真皮組織清洗干凈至澄清；

1.3將真皮組織剪碎剪小，用IV型膠原酶，其濃度為600-800U/ml，37℃消化2小時；

1.4用生理鹽水稀釋膠原酶，離心，1000-1500rpm，5分鐘，如此重復洗3次；

1.5基礎培養基重懸沉淀，接種于100mm培養皿中，放置于5％CO₂，37℃的培養箱中培養；

2.人皮膚成纖維細胞傳代培養

2.1待細胞融合度達到90％時，用0.25％胰酶在37℃培養箱中消化約3-5min，在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙增大后，加入基礎培養液終止消化；

2.2離心，1300rpm，5分鐘；

2.3棄去上清液，基礎培養液重懸沉淀，用吸管吹打細胞，以1∶4比例接種至新的100mm培養皿中進行傳代培養；

2.4待人成纖維細胞培養至4-6代時，用于成纖維細胞膜片制備；

3.成纖維細胞膜片制備

3.1取4-6代的成纖維細胞經過0.25％胰酶消化，1000-1500rpm離心；

3.2分別用基礎培養基和添加組分的完全培養基重懸沉淀，吹打均勻；

3.3按照4*10⁴/cm²接種至培養皿中；

3.4間隔2-4天更換基礎培養基和完全培養基；

3.5待細胞長至第八天時，可見添加完全培養基的培養皿底層細胞已形成膜片，膜片的邊緣翹起來，用鑷子可將整張膜片掲起。