[發(fā)明專利]一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT?PCR診斷試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710018128.4 | 申請日： | 2017-01-11 |
| 公開（公告）號： | CN106834538A | 公開（公告）日： | 2017-06-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 于新友;李峰;李天芝;沈志強;吳家強;孫文博 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司37205 | 代理人： | 許靜 |
| 地址： | 256600 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 鑒別 流行性 腹瀉 病毒 疫苗 弱毒株 流行 一步法 rt pcr 診斷 試劑盒 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明專利涉及獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的診斷技術(shù)，具體是一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒。
背景技術(shù)
腹瀉是當(dāng)前威脅養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疾病，導(dǎo)致豬腹瀉的原因很多，包括營養(yǎng)性、細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一種因素，近年來，引起豬腹瀉最主要病毒為豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，它能引起豬的豬流行性腹瀉(PED)，PED是豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為主要特征，發(fā)生與流行呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，多發(fā)生于冬季12月至次年2月寒冬季節(jié)，也可發(fā)生于其它季節(jié)，各日齡豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬的感染發(fā)病率可達(dá)100％，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，母豬發(fā)病率為15-90%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。1978年，比利時和英國首次報道了豬流行性腹瀉，此后在世界多國均見有PEDV感染的報道。1976年，中國首次出現(xiàn)PEDV感染的報道，自1980年后期呈現(xiàn)大面積流行。
目前尚無有效的藥物治療豬流行性腹瀉，該病一旦爆發(fā)，給豬場造成毀滅性的打擊，采用疫苗進行預(yù)防是控制該病的最有效的手段，弱毒活疫苗與滅活疫苗相比具有免疫作用時間長，免疫效果牢固，可形成局部和全身免疫等優(yōu)點，
ORF3基因是PEDV的一個附屬基因，編碼碼一種離子通道蛋白，與病毒的毒力有關(guān)，是造成強弱毒差異的主要基因，是弱毒株重要的分子標(biāo)記。
目前國內(nèi)外商品化的PEDV弱毒疫苗株均為ORF3基因缺失毒株，如我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9和DR13株等，這些毒株的ORF3基因在245-294bp均存在核苷酸缺失，而缺失區(qū)域周圍的序列卻相對保守，不同毒株的 ORF3 基因相似性達(dá)到97.8%，在臨床上如何區(qū)分疫苗免疫與流行毒株，對仔豬腹瀉疫情的預(yù)警及豬場流行性腹病毒的凈化具有重要意義。
目前，在國內(nèi)有學(xué)者嘗試建立相關(guān)的鑒別診斷方法，如修金生等建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒野毒和疫苗弱毒的熒光定量 RT-PCR 檢測方法，對操作人員要求高，且成本較高，目前只應(yīng)用于實驗室檢測，不適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用。李長龍、朱海俠等建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗株與野毒株的 RT-PCR 檢測方法，均為兩步法RT-PCR檢測方法，且沒檢測的敏感性進行研究，操作煩瑣，擴增反應(yīng)時間長，模板RNA的易降解。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的是目的在于提供一種用于鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，該試劑盒操作簡便、靈敏度高、特異性好可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株，對豬場流行性腹瀉病毒病的早期鑒別診斷、防控及凈化有重要意義。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種用于鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，該試劑盒包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL 酶緩沖液、300μL RNaseFreedH2O、40μL 混合引物、20μL陽性對照、20μL陰性對照、80μLDL2000及25μL6×LoadingBuff，
所述的引物 P1 序列為 ：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'
所述的引物 P2 序列為 ：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'
所述的陰性對照為滅菌的DEPC水。
所述的陽性對照為豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。
所述混合引物中各條引物的濃度均為15μmo1/L。
所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor組成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor的體積比為1:1:1。
所述的酶緩沖液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution組成，所述dNTP Mixture的濃度為400μmo1/L。
所述RT-PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)在25 μL體系中進行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、兩種病毒RNA混合物各0.5μL，，加RNase Freed H2O至25μL。
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