[發明專利]一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT?PCR診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201710018128.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106834538A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 于新友;李峰;李天芝;沈志強;吳家強;孫文博
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司37205
• 代理人: 許靜

1.一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：其包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL酶緩沖液、300μL Rnase Freed H₂O、40μL混合引物、20μL 陽性對照、20μL陰性對照、80μL DL2000及25μL 6×Loading Buffer，所述混合引物包括上游引物P1：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'，下游引物P2：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'。

2.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述陰性對照為滅菌的DEPC水。

3.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述陽性對照為豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。

4.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述混合引物中各條引物的濃度均為15μmo1/L。

5.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor組成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor的體積比為1:1:1。

6.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述的酶緩沖液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution組成，所述dNTP Mixture的濃度為400μmo1/L。

7.根據權利要求1所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述RT-PCR反應體系為：反應在25 μL體系中進行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、兩種病毒RNA混合物各0.5μL，加RNase Freed H₂O至25μL。

8.根據權利要求7所述的一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其特征在于：所述RT-PCR擴增反應條件為：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火溫度 52℃ 20s；72℃ 20s；40個循環；最后72℃延伸10 min。