[發明專利]ctDNA的數字化深度測序技術

在審

• 申請號: 201710017802.7
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106701956A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 李福根;熊磊;陳閱軍;湯先念;金其煌;覃灝;許青
• 申請（專利權）人: 上海思路迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司11003
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體涉及ctDNA的測序技術。

背景技術

隨著檢測費用的降低，下一代測序技術(Next-generation sequencing，NGS)，即大規模平行測序技術已被廣泛的應用到實體瘤的基因突變診斷中，以輔助靶向藥物的治療。美國國立綜合癌癥網絡(the National Comprehensive Cancer Network，NCCN)發布針對非小細胞肺癌臨床實踐指南中，因可以同時有效的檢測多種基因突變，推薦使用NGS技術在微小組織樣本平行檢測多種基因突變(EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、ROS1及RET)以指導不同靶向治療方案。

但腫瘤組織基因突變檢測存在局限性，例如取樣困難，腫瘤組織依賴手術或穿刺；取樣次數有限，無法實時反應患者的突變情況；穿刺獲得的少量樣本很難全面的展示腫瘤的異質性信息等。自從cfDNA(cell-free DNA)與ctDNA(cell-free circulating tumor DNA)被發現，科學家就致力于通過無創方式檢測腫瘤基因變化。相對于組織檢測，cfDNA檢測是非侵入式，可實時取樣，監控治療效果、復發及耐藥情況等，另外，cfDNA也含有更豐富的信息，可解決腫瘤組織檢測時的異質性問題。

ctDNA在cfDNA中的含量很低，通常小于0.1％，使得如果通過NGS檢測ctDNA評估患者基因突變，就需要極低的檢測下限。以目前NGS技術，這些極低的突變被測序底噪掩蓋掉，導致假陰性；如果檢測這些低頻突變，則同時會將測序底噪當作陽性突變，造成假陽性。

NGS液體活檢在檢測腫瘤基因突變時需要極低的檢測下限，較高靈敏度與特異性。現有Illumina NGS平臺測序錯誤率在0.3％～0.5％，如果通過現有技術檢測0.1％以下的突變，會有很多的假陽性，這限制了它在液體活檢中的應用。cfDNA通過凋亡細胞中不被核小體區域的DNA經核酸酶剪切后釋放到血液中，不同細胞來源的DNA會剪切成相同的DNA分子。現有技術在測序分析后這部分來源不同的相同DNA分子通過去重而除去，降低了有效測序深度，減弱了突變的分析。同時cfDNA含量低，從患者血液中只能分離到幾十納克的cfDNA，現有的方法對少量cfDNA建庫困難。

發明內容

本發明通過在建庫所使用的接頭中加入數字信號區別不同來源的相同DNA分子，增加有效測序深度，可以降低NGS檢測過程中的錯誤底噪、提高檢測下限，同時達到較高的靈敏度。

根據本發明的一個方面，提供用于cfDNA建庫的含有數字信號的接頭，所述含有數字信號的接頭包括兩種接頭序列，所述兩種接頭序列是在下述的P5和P7接頭序列的基礎上進行序列修飾得到的：

P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'P7：

5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；

其中：

兩種接頭序列中的一種是多種序列的混合物，組成混合物的每種序列分別是在上述P5接頭序列的5'端第29位的C和第30位的A之間插入n堿基隨機序列得到的序列且每種序列中的n堿基隨機序列各不相同，兩種接頭序列中的另一種是上述P7接頭序列；或者

兩種接頭序列中的一種是多種序列的混合物，組成混合物的每種序列分別是用n堿基隨機序列取代上述P7接頭序列中的index序列得到的序列且每種序列中的n堿基隨機序列各不相同，兩種接頭序列中的另一種是上述P5接頭序列；

其中n是選自2-9的任一個數字。

應當理解，本發明中，n可以是2-9的任何一個數字，例如2、3、4、5、6、7、8、9。當兩種接頭序列中的一種是多種序列的混合物時，在組成混合物的每種序列中所含有的隨機序列的堿基數目是相同的。

本領域技術人員應當理解，上述接頭中的index序列是指用于區分不同樣品的標簽序列。

本文中“堿基”和“核苷酸”可以互換使用，指A、T、C或G中的任何一種。本文中所述的“n堿基隨機序列”是指連續n個核苷酸的序列，其中每一個核苷酸都獨立地隨機選自A、T、C、G中的任何一個。本文中的“n堿基隨機序列”構成數字信號，用于在構建文庫時給不同來源的相同DNA分子加上含有不同數字信號的接頭，從而區分測序結果中的不同來源的相同DNA分子。