[發明專利]用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應用在審

申請號：	201710017455.8	申請日：	2017-01-11
公開（公告）號：	CN106754906A	公開（公告）日：	2017-05-31
發明（設計）人：	張巖;劉瑩瑩;王顥婷;邢婉麗;程京	申請（專利權）人：	博奧生物集團有限公司
主分類號：	C12N15/11	分類號：	C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司11245	代理人：	關暢,何葉喧
地址：	102206 北***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	用于檢測青霉抗生素耐藥基因 lamp 引物組合及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應用。

背景技術

我國是抗生素濫用情況最為嚴重的國家之一，然而隨著抗生素使用量的加大，細菌耐藥情況也越發嚴重。抗生素種類繁多，作用機制多樣，其中β-內酰胺類抗生素中的碳青霉烯類可以通過與革蘭氏陽性細菌或陰性細菌中大分子量青霉素結合蛋白(PBP)的高度親和力，通過抑制細菌細胞壁合成而發揮殺菌作用。耐藥細菌體內的耐藥基因(如耐藥基因OXA-23、耐藥基因OXA-24、耐藥基因OXA-58、耐藥基因OXA-66、耐藥基因KPC-2、耐藥基因IMP-4或耐藥基因VIM-2)則可通過產生滅活碳青霉烯類抗生素的β-內酰胺酶，OprD缺乏或存在外排泵，PBP靶位改變導致親和力下降等機制完成使碳青霉烯類抗生素失活的作用。

細菌產生耐藥性的原因很多，主要分為產生滅活酶、抗菌藥物作用靶位改變、改變細菌外膜通透性、影響主動泵出系統、影響細菌被膜的形成及交叉耐藥性等六方面。

目前關于對細菌耐藥性的檢測主要有以下幾種方法：細菌耐藥表型的檢測(包括耐藥篩選試驗、折點敏感試驗及藥敏試驗的儀器化和自動化等)、β-內酰胺酶檢測、特殊耐藥菌檢測和耐藥基因檢測等。其中最為直觀的檢測方法是以體外培養的藥物檢測，但仍存在培養時間長等缺陷。隨著耐藥機理的研究逐步深入，分子生物學方法檢測細菌耐藥逐漸被臨床接受。常見檢測細菌耐藥基因的方法主要有：聚合酶鏈式反應、PCR-限制性片段長度多態性分析、PCR-單鏈構象多態性分析、生物芯片技術、自動DNA測序等。傳統的基因鑒定方法為PCR法和DNA測序法，其中傳統的PCR法檢測周期較長，通常需要3-4個小時；Sanger DNA測序法對引物特異性要求較高，且價格較昂貴，后期數據分析較復雜，不適合臨床推廣使用。

環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應。LAMP針對靶序列的6個區域設計4條特異引物，利用具備鏈置換功能的DNA聚合酶在恒定溫度下不斷復制擴增DNA。為了提高反應效率，可在反應體系中添加兩條環引物，使之分別與莖環結構結合，啟動鏈置換合成，循環復制。

LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適合在基層開展LAMP試劑盒的應用推廣。LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。

發明內容

本發明的目的為提供一種用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應用。

本發明首先提供了一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ、引物組Ⅵ和引物組Ⅶ組成；

(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ、所述引物組Ⅵ和所述引物組Ⅶ中的任意兩個、任意三個、任意四個、任意五個或任意六個組成；

(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ、所述引物組Ⅵ或所述引物組Ⅶ。

所述引物組Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成；

所述引物Ⅰ-F3可為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3可為如下(b3)或(b4)；