[發(fā)明專利]在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710017237.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106947704B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柳永;劉士旺;鮑文娜
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江科技學(xué)院
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明提供一種在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除方法，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或全基因合成的方法獲得目標(biāo)敲除基因上下游序列后，將上下游序列按與原基因相反方向連接，并插入到載體質(zhì)粒上構(gòu)建環(huán)狀克隆載體，對環(huán)狀克隆載體進行線性化處理得到線型雙鏈DNA，將線型雙鏈DNA經(jīng)由5’→3’核酸外切酶處理，形成線型3’突出長粘端雙鏈DNA后轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘細(xì)胞。本發(fā)明借助特殊的外源DNA結(jié)構(gòu)類型，在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除。定點基因敲除準(zhǔn)確率可達(dá)到25～70％，能夠大幅減少灰蓋鬼傘定點基因敲除工作量，在灰蓋鬼傘功能基因研究及基因工程菌株構(gòu)建等方面具有較大應(yīng)用潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，主要是涉及一種灰蓋鬼傘高準(zhǔn)確率定點基因敲除方法。

背景技術(shù)

灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)屬擔(dān)子菌亞門鬼傘科鬼傘屬真菌，全基因組序列已知，是大型絲狀真菌模式生物。以英國皇家科學(xué)院院士Lorna教授為代表的研究群體，基于灰蓋鬼傘開展了大量有關(guān)絲狀真菌性別識別、發(fā)育機理和外源基因表達(dá)研究工作?；疑w鬼傘定點基因敲除是指將外源DNA導(dǎo)入灰蓋鬼傘靶向敲除或失活某些功能基因的研究。目前灰蓋鬼傘定點基因敲除效率很低，一般在5％左右。多年來，低下的定點基因敲除效率，嚴(yán)重滯緩了灰蓋鬼傘功能基因組研究。同時這一低基因同源重組現(xiàn)象在其他大型真菌(主要指大型食藥用擔(dān)子菌)中也普遍存在，這導(dǎo)致獲得大型真菌基因敲除菌株難度較高，進而對相關(guān)功能基因研究產(chǎn)生極大的不利影響。

定點基因敲除是基因同源重組的結(jié)果，而外源DNA介導(dǎo)基因同源重組的效率與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)關(guān)系密切。大量研究工作已經(jīng)證實，在小型絲狀真菌中(如曲霉中)，線型外源dsDNA定點基因敲除準(zhǔn)確率普遍高于超螺旋dsDNA，這說明DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其定點基因敲除活性間的直接相關(guān)性，是已經(jīng)獲得公認(rèn)的科學(xué)事實。目前在進行灰蓋鬼傘定點基因敲除時，通常采用環(huán)狀或超螺旋質(zhì)粒DNA、或線型雙鏈DNA作為外源DNA，其兩個末端可為平端、短5’突出粘端(常見為4bp突出粘端)、或短3’突出粘端(常見為4bp突出粘端)。由于通常細(xì)胞中非同源重組效率遠(yuǎn)高于同源重組，因此在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除并非易事。因此，如能建立新的高效方法，將定點基因敲除準(zhǔn)確率提高到50％以上，則針對每個克隆試驗隨機挑選2-3個轉(zhuǎn)化子即可有效獲得目標(biāo)基因克隆，篩選工作量將大幅降低。本發(fā)明針對高準(zhǔn)確率定點基因敲除問題，公開一種新型DNA結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)的高準(zhǔn)確率灰蓋鬼傘定點基因敲除方法。該方法可有效提高灰蓋鬼傘定點基因敲除準(zhǔn)確率，為灰蓋鬼傘遺傳學(xué)研究、功能基因研究及基因工程菌株培育提供高效技術(shù)手段，同時為其他大型食用菌基因敲除研究提供參考。本發(fā)明設(shè)計關(guān)鍵創(chuàng)新點-“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用尚未見報道

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除的技術(shù)方法?；疑w鬼傘定點基因敲除基于基因同源重組原理，通過外源DNA在基因組中的定點插入實現(xiàn)定點基因敲除。在定點基因敲除過程中，外源DNA的3’單鏈末端對目標(biāo)DNA區(qū)段的入侵是實現(xiàn)同源基因克隆的分子基礎(chǔ)。當(dāng)以平端或短粘端線型雙鏈DNA為外源DNA時，進入細(xì)胞后需經(jīng)胞內(nèi)核酸酶處理形成3’端長單鏈末端，然后發(fā)生單鏈入侵，進而實現(xiàn)基因同源重組。由于外源DNA在細(xì)胞內(nèi)形成3’端長單鏈末端的效率低下，導(dǎo)致定點基因敲除效率低下，進而導(dǎo)致定點基因敲除準(zhǔn)確率低下。本發(fā)明在體外制備了攜帶3’端長單鏈末端的外源DNA，即“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”，解決了細(xì)胞內(nèi)形成攜帶3’端長單鏈末端效率低下的問題，從而實現(xiàn)了高準(zhǔn)確率定點基因敲除，具體表現(xiàn)為灰蓋鬼傘中的高準(zhǔn)確率定點基因敲除。

在灰蓋鬼傘中實現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或全基因合成的方法獲得目標(biāo)敲除基因上下游序列后，將上下游序列按與原基因相反方向連接，并插入到載體質(zhì)粒上構(gòu)建環(huán)狀克隆載體，對環(huán)狀克隆載體進行線性化處理得到線型雙鏈DNA，將線型雙鏈DNA經(jīng)由5’→3’核酸外切酶處理，形成線型3’突出長粘端雙鏈DNA后轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘細(xì)胞。

進一步地，所述線型3’突出長粘端雙鏈DNA兩端各攜帶1段與目標(biāo)敲除基因上游或下游序列相同的同源序列。