[發(fā)明專利]在灰蓋鬼傘中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710017237.4
• 申請(qǐng)日: 2017-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN106947704B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳永;劉士旺;鮑文娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江科技學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.在灰蓋鬼傘中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或全基因合成的方法獲得目標(biāo)敲除基因上下游序列后，將上下游序列按與原基因相反方向連接，并插入到載體質(zhì)粒上構(gòu)建環(huán)狀克隆載體，對(duì)環(huán)狀克隆載體進(jìn)行線性化處理得到線型雙鏈DNA，將線型雙鏈DNA經(jīng)由T5核酸外切酶處理，酶用量為400U/nmol線型雙鏈DNA載體，處理溫度55℃，處理時(shí)間為5min，經(jīng)核酸酶處理后3’端單鏈粘端長(zhǎng)度為300nt，形成線型3’突出長(zhǎng)粘端雙鏈DNA后轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘細(xì)胞，所述線型3’突出長(zhǎng)粘端雙鏈DNA兩端各攜帶1段與目標(biāo)敲除基因上游或下游序列相同的同源序列，其兩個(gè)3’突出粘端的延伸方向均指向目標(biāo)基因的編碼區(qū)，即兩個(gè)3’突出粘端相向而行共同指向目標(biāo)敲除基因區(qū)段，所述同源序列的長(zhǎng)度為500bp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，線型3’突出長(zhǎng)粘端雙鏈DNA轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘細(xì)胞的方法是電擊介導(dǎo)法、聚乙二醇介導(dǎo)法、氯化鋰介導(dǎo)或醋酸鋰介導(dǎo)法。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，線型3’突出長(zhǎng)粘端雙鏈DNA轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘細(xì)胞的方法是原生質(zhì)體介導(dǎo)法。