[發明專利]在灰蓋鬼傘中實現高準確率定點基因敲除的方法有效
| 申請號： | 201710017237.4 | 申請日： | 2017-01-11 |
| 公開（公告）號： | CN106947704B | 公開（公告）日： | 2020-07-24 |
| 發明（設計）人： | 柳永;劉士旺;鮑文娜 | 申請（專利權）人： | 浙江科技學院 |
| 主分類號： | C12N1/15 | 分類號： | C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283 | 代理人： | 向慶寧 |
| 地址： | 310023 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 灰蓋鬼傘中 實現 準確率 定點 基因 方法 | ||
【權利要求書】：
1.在灰蓋鬼傘中實現高準確率定點基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶鏈式反應或全基因合成的方法獲得目標敲除基因上下游序列后，將上下游序列按與原基因相反方向連接，并插入到載體質粒上構建環狀克隆載體，對環狀克隆載體進行線性化處理得到線型雙鏈DNA，將線型雙鏈DNA經由T5核酸外切酶處理，酶用量為400U/nmol線型雙鏈DNA載體，處理溫度55℃，處理時間為5min，經核酸酶處理后3’端單鏈粘端長度為300nt，形成線型3’突出長粘端雙鏈DNA后轉化灰蓋鬼傘細胞，所述線型3’突出長粘端雙鏈DNA兩端各攜帶1段與目標敲除基因上游或下游序列相同的同源序列，其兩個3’突出粘端的延伸方向均指向目標基因的編碼區，即兩個3’突出粘端相向而行共同指向目標敲除基因區段，所述同源序列的長度為500bp。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，線型3’突出長粘端雙鏈DNA轉化灰蓋鬼傘細胞的方法是電擊介導法、聚乙二醇介導法、氯化鋰介導或醋酸鋰介導法。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，線型3’突出長粘端雙鏈DNA轉化灰蓋鬼傘細胞的方法是原生質體介導法。
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