[發明專利]一種農藥對蜜蜂幼蟲的毒性評價方法

在審

• 申請號: 201710016963.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106614410A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 何明遠;吳遲;薛白;王長賓;朱志峰;才冰;崔馨月
• 申請（專利權）人: 北京依科世?？萍加邢薰?/a>
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)11390
• 代理人: 胡劍輝

技術領域

本發明涉及農藥風險評價方法，具體涉及一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法。

背景技術

蜜蜂是農業生產中主要的授粉物種。蜜蜂授粉可減少農藥化肥的施用，適宜生態農業和綠色農業的發展；對維護農業生物多樣性、穩定性具有重要生態功能。有研究顯示：全球約87.5％的開花植物依靠昆蟲授粉，其中87種為主要糧食作物，占世界糧食總產量的35％，而蜜蜂約占授粉昆蟲總數的80％，無論是人工飼養還是野生存在，都在作物授粉方面發揮著巨大作用。同時蜜蜂授粉所產生的經濟效益也相當可觀，每年僅我國由蜜蜂傳花授粉帶來的經濟效益就高達150億元。因此，蜜蜂具有重大的生態和經濟價值。但蜜蜂對農藥敏感程度極高，濫用或誤用農藥都將破壞蜜蜂棲息地及其食物來源，從而對蜜蜂產生嚴重威脅。1990年至今，因農藥中毒導致蜜蜂死亡、蜂群數量驟減的現象遍及北美、歐洲、亞洲等許多國家，已成為全球普遍關注的環境污染與生物安全問題。

為保護生態系統健康，從源頭控制高風險性農藥對環境生物產生的潛在不良影響，我國環保部、農業部也逐漸將農藥對蜜蜂生物毒性與安全性評價列為農藥登記管理、農藥使用環境安全管理的重要內容之一，并制定了農藥對蜜蜂急性毒性試驗準則。但迄今為止，我國作為農藥生產和使用第一大國，并未建立完整的農藥對蜜蜂安全性風險評價體系?？傮w來看：我國農藥對蜜蜂生物安全性風險評價工作比較落后，表現在實驗方法上缺乏亞慢性、慢性試驗方法，評價體系缺乏立體多層次實驗。

發明內容

本發明公開了一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性試驗的方法和藥劑對蜜蜂幼蟲NOEC/NOED值的毒性測定方法，完善了農藥對蜜蜂慢性毒性試驗評價體系。

本發明的實驗方案為：

一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，步驟為：

(1)試驗生物為1日齡的蜜蜂幼蟲，3～6日齡開始暴露染毒；以系列濃度組進行預備試驗；根據預備試驗確定的濃度范圍，正試驗設置不少于5個覆蓋EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的濃度組，同時設空白對照組，當使用溶劑時，增加設置溶劑對照組；

(2)正試驗結果觀察；于第4d～8d及第15d觀察并記錄幼蟲死亡數、其它異常情況，身體僵硬不動或輕微觸碰無反應或第15d未化蛹的幼蟲則判定為死亡，同時將死亡的幼蟲去除，第22d觀察并記錄蛹死亡數、羽化數及觀察到的異常情況；

(3)藥劑對蜜蜂幼蟲EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的測定；蜜蜂幼蟲毒性試驗以羽化率為主要評價指標，統計蜜蜂發育的幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率，進行統計學分析計算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析對各個濃度處理組與對照組間進行差異顯著性分析，獲得供試物對蜜蜂羽化影響的NOEC/NOED。

不同時間觀察并記錄蜜蜂不同蟲態的死亡數、化蛹、羽化成蜂情況。計算幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率，半效應濃度/半效應劑量(EC₅₀/ED₅₀)；將供試物處理組和空白對照組的羽化率進行差異顯著性分析，確定無可見效應濃度/無可見效應劑量(NOEC/NOED)。不可見效應濃度(NOEC)值用通過方差分析得出：若與空白試驗組沒有顯著性差異的最高濃度，即為NOEC值；或通過濃度-效應關系得出：與空白實驗組相比，根據實驗測試所得的濃度-效應關系，其影響程度低于空白的10％的濃度，即視為NOEC值。

所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，蜜蜂幼蟲獲得的方法為：

(1)首先，將蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中，禁閉24h，待其產卵后釋放蜂王，產卵75h后用移蟲針將1日齡的幼蟲隨機轉移至溫度34℃～35℃的育王臺基中，每個臺基放入1只幼蟲，然后將移入了幼蟲的王臺基置于24或48孔細胞培養板；每個培養板含有來自3個種群的幼蟲；幼蟲在試驗條件下，用人工飼料飼養；

(2)在化蛹培養板中放入紙巾；將巾貼合孔的底部和邊緣，將蛹培養板和蓋子進行紫外滅菌15分鐘；當D6～D8蜜蜂幼蟲消耗完所有食物時，就將幼蟲從培養板轉移到化蛹培養板中；

(3)在幼蟲或預蛹轉至化蛹板之前，保持相對濕度95％±5％；預蛹轉至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相對濕度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至試驗結束，保持相對濕度50％～80％；試驗期間將干燥器放置于蜜蜂幼蟲孵化器中，使干燥器溫度均勻保持在34℃～35℃，黑暗的條件下進行；蜜蜂幼蟲達到3日齡開始試驗。