[發明專利]一種農藥對蜜蜂幼蟲的毒性評價方法

在審

• 申請號: 201710016963.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106614410A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 何明遠;吳遲;薛白;王長賓;朱志峰;才冰;崔馨月
• 申請（專利權）人: 北京依科世福科技有限公司
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)11390
• 代理人: 胡劍輝

1.一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：步驟為：

(1)試驗生物為1日齡的蜜蜂幼蟲，3～6日齡開始暴露染毒；以系列濃度組進行預備試驗；根據預備試驗確定的濃度范圍，正試驗設置不少于5個覆蓋EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的濃度組，同時設空白對照組，當使用溶劑時，增加設置溶劑對照組；

(2)正試驗結果觀察：于第4d～8d及第15d觀察并記錄幼蟲死亡數、其它異常情況，身體僵硬不動或輕微觸碰無反應或第15d未化蛹的幼蟲則判定為死亡，同時將死亡的幼蟲去除，第22d觀察并記錄蛹死亡數、羽化數及觀察到的異常情況；

(3)藥劑對蜜蜂幼蟲EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的測定：蜜蜂幼蟲毒性試驗以羽化率為主要評價指標，統計蜜蜂發育的幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率，進行統計學分析計算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析對各個濃度處理組與對照組間進行差異顯著性分析，獲得供試物對蜜蜂羽化影響的NOEC/NOED。

2.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：蜜蜂幼蟲獲得的方法為：

(1)首先，將蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中，禁閉24h，待其產卵后釋放蜂王，產卵75h后用移蟲針將1日齡的幼蟲隨機轉移至溫度34℃～35℃的育王臺基中，每個臺基放入1只幼蟲，然后將移入了幼蟲的王臺基置于24或48孔細胞培養板；每個培養板含有來自3個種群的幼蟲；幼蟲在試驗條件下，用人工飼料飼養；

(2)在化蛹培養板中放入紙巾，將紙巾貼合孔的底部和邊緣，將蛹培養板和蓋子進行紫外滅菌15分鐘；當D6～D8蜜蜂幼蟲消耗完所有食物時，就將幼蟲從培養板轉移到化蛹培養板中；

(3)在幼蟲或預蛹轉至化蛹板之前，保持相對濕度95％±5％；預蛹轉至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相對濕度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至試驗結束，保持相對濕度50％～80％；試驗期間將干燥器放置于蜜蜂幼蟲孵化器中，使干燥器溫度均勻保持在34℃～35℃，黑暗的條件下進行；蜜蜂幼蟲達到3日齡開始試驗。

3.如權利要求2所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：幼蟲人工飼料的成分包括但不限于蜂皇漿、酵母提取物、果糖、葡萄糖；蜜蜂幼蟲使用的三種飼料的成分及重量份為：

飼料A為：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝0.9:5.3:5.3:44.25:44.25；

飼料B為：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝1.3:6.4:6.4:42.95:42.95；

飼料C：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝2:9:9:30:50；1日齡飼喂20μL飼料A，2日齡不進行飼喂，3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C。

4.如權利要求3所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：飼料配置時需先將果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于無菌水后再與新鮮王漿混勻；混勻食物采用采用手動攪拌和渦旋振蕩的方法；飼料新鮮配制并保存在0～5℃的冰箱里；或提前制備，冷凍保存直至使用。

5.如權利要求2所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：步驟(2)中的紙巾為：1m×2cm的紙巾。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(1)移蟲前將培養板、移蟲針、人工育王臺基浸沒在70％酒精至少30min進行殺菌后，晾干待用；往每個培養板移蟲時間≤20分鐘；使用移液器向每個王臺基內供應食物。

7.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：所述的暴露染毒的步驟為：每天用混有供試物的飼料飼喂蜜蜂幼蟲，3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C；使用水溶解的供試物，投喂的含毒飼料中受試溶液的量為≤10％；或使用有機溶劑溶解，投喂的含毒飼料中受試溶液的量≤2％。

8.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，其特征在于：預備試驗使用細胞培養板，設置空白與溶劑對照組：每個濃度3個重復，每個重復12頭幼蟲。