[發明專利]一種以牛大力花藥為外植體的再生方法

有效

• 申請號: 201710016948.X
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106613991B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 李志英;黃碧蘭;徐立
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

1.一種以牛大力花藥為外植體的再生方法，其特征在于，其具體步驟如下：

1)、外植體獲取

在牛大力盛花期，選取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾，用0.1％HgCl₂消毒10min后，無菌水沖洗4次，吸干水分后取花藥；或75％酒精噴霧，于超凈工作臺吹干后取花藥；或直接依次剝掉花萼和部分花瓣，用尖頭鑷子小心的取花藥；

2)、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導

將獲取的牛大力花藥接種在愈傷組織培養基上，培養溫度24～26℃，暗培養；培養25天時，肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織；繼續培養，60天后，部分愈傷組織形成胚性愈傷組織；所述愈傷組織培養基是以改良的MS為基本培養基，并添加2,4-D 3.5mg/L以下、6-BA0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8；

3)、胚性愈傷組織增殖誘導

將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m^-2·s^-1；培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚；將子葉型胚切成2╳2～5mm的小塊，接入增殖培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m^-2·s^-1；培養40天后，可分化出胚性愈傷組織；所述子葉胚誘導培養基是以改良的MS為基本培養基，并添加6-BA 2mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L、10％椰子水，pH5.8；所述增殖培養基是以改良的MS為基本培養基，并添加2,4-D 2.0mg/L、BA 0.5mg/L、CH 1.0mg/L、Glu0.5mg/L、10％椰子水、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH5.8；

4)、胚狀體的誘導

將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m^-2·s^-1；培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育胚狀體；所述胚誘導培養基以改良的MS為基本培養基，添加6-BA 1.0mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8；

5)、胚狀體發育誘導及壯苗培養

將誘導出的胚狀體單個剝離并轉接到胚發育培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m^-2·s^-1；培養90天后，形成具有芽和根的完整小植株；將發育成的小植株轉接到壯苗培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m^-2·s^-1；培養60天后，小植株莖伸長至5cm以上，葉片數2-3，部分展開，根系發育良好，形成壯苗；所述胚發育培養基是以改良的MS為基本培養基，并添加6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.01～0.15mg/L、10％CW、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH 5.8；所述壯苗培養基是以改良MS為基本培養基，并添加NAA 0.1～0.5mg/L、IBA 0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH 5.8；

上述改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上，在其它成分和含量不變的條件下將肌醇濃度調整為200mg/L。