[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法

在審

• 申請號: 201710016843.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106699881A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 詹先強;陳晟生;陳樨;賴婷婷;陳景容;姚堯;元麗花;賴道華;黃玉婷
• 申請（專利權）人: 福州大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司35211
• 代理人: 張耕祥

技術領域

本發明屬于獸用醫藥生物技術領域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法。

背景技術

流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea ofSwine，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬接觸性腸道傳染病。以嘔吐、腹瀉和脫水為特征，可發生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。哺乳豬、架子豬或肥育豬的發病率很高，尤以哺乳豬受害最為嚴重，母豬發病率變動很大，約為15-90%。病豬是主要傳染源。發病豬癥狀的輕重隨年齡的大小而有差異，年齡越小，癥狀越重。一周齡內新生仔豬發生腹瀉后3-4天，呈現嚴重脫水而死亡，死亡率可達50%，最高的死亡率達100%。斷奶豬、母豬常呈精神萎頓、厭食和持續性腹瀉大約一周，并逐漸恢復正常。少數豬恢復后生長發育不良。肥育豬在同圈飼養感染后都發生腹瀉，一周后康復，死亡率1--3%。成年豬癥狀較輕，有的僅表現嘔吐，重者水樣腹瀉3-4天可自愈。而豬流行性腹瀉病毒陽性血清是目前主要應用于鑒別、檢驗、診斷的蛋白類物質，此免疫球蛋白（抗體）是一種能攻擊異己物質（抗原）并促進嗜中性粒細胞和巨噬細胞吞噬免疫球蛋白-抗原復合物的蛋白質，因此它們在清除細菌和病毒中起著重要作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用兔或豚鼠制備豬流行性腹瀉病毒陽性血清的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，包括以下步驟：

1) 篩選豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性的動物作為實驗動物，對每只實驗動物進行免疫接種：

用豬流行性腹瀉病毒抗原進行基礎免疫：對每只實驗動物皮下或肌肉注射0.5-2mL豬流行性腹瀉病毒抗原進行基礎免疫；

用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進行3-5次免疫：基礎免疫7--10天后對每只實驗動物進行皮下或肌肉注射豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進行3-5次免疫接種，每次免疫接種的時間間隔為7-10天，第1次接種量為1-3頭份，以后每次接種量比上一次增加2-3頭份或者做倍增接種；

2）最后一次免疫后28-42天，無菌采集實驗動物血清，以細胞中和抗體效價檢測法檢測，確認血清抗體為陽性且細胞中和抗體效價在1：256以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。收集的豬流行性腹瀉病毒陽性血清經過輻照、過濾后抽樣做無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗等步驟，將無細菌、霉菌、支原體、外源病毒污染的免疫動物血清進行分裝、凍干后，再次抽樣檢驗，確認無污染的陽性血清凍存備用。

所述實驗動物為小鼠、豚鼠或兔。作為實驗用的動物，首先采集其血清檢測，驗證其均不具有豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬Ⅱ型圓環病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗體。

所述步驟1）的免疫為多點免疫，所述多點免疫為2點、3點或4點免疫。

所述步驟2) 無菌采集實驗動物血清的具體操作為：采集實驗動物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無菌環境下分離血清。

本發明所述中和抗體效價的測定方法如下：

S1： 將采集的實驗動物血清在56℃下滅活30min，然后用維持液對血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，每個稀釋度的血清分別與豬流行性腹瀉病毒抗原于37℃環境下中和60min以上，得到中和液；

S2：用細胞板培養VERO細胞，當VERO細胞生長24小時以上，細胞密度達到致密單層時，棄去培養液，取0.1mL上述中和液接種于細胞板上，每個稀釋度的血清中和液分別接種6孔細胞，同時設不中和的病毒陽性對照細胞6孔和接種維持液的陰性對照細胞6孔；

S3：將細胞板置于37℃的CO₂培養箱中培養120h，并每天觀察細胞病變情況，以細胞不產生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價。

所述步驟S1的維持液為DMEM維持液。

所述步驟S1的豬流行性腹瀉病毒抗原的濃度為200TCID₅₀/0.1mL。

所述步驟S1的倍比稀釋，稀釋至血清與維持液的比例1:256以上。

所述步驟S1每個稀釋度的血清與豬流行性腹瀉病毒抗原等量混合。

所述細胞板為96孔細胞板。