[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710016843.4 | 申請日： | 2017-01-11 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN106699881A | 公開（公告）日： | 2017-05-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 詹先強(qiáng);陳晟生;陳樨;賴婷婷;陳景容;姚堯;元麗花;賴道華;黃玉婷 | 申請（專利權(quán)）人： | 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C07K16/10 | 分類號(hào)： | C07K16/10;C07K16/06 |
| 代理公司： | 福州君誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司35211 | 代理人： | 張耕祥 |
| 地址： | 350000 福建省*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 種豬 流行性 腹瀉 病毒 陽性 血清 制備 方法 | ||
1.一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：其包括以下步驟：
1) 篩選豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種：
用豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫：對每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或肌肉注射0.5-2mL豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；
用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫：基礎(chǔ)免疫7--10天后對每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮下或肌肉注射豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫接種，每次免疫接種的時(shí)間間隔為7-10天，第1次接種量為1-3頭份，以后每次接種量比上一次增加2-3頭份或者做倍增接種；
2）最后一次免疫后28-42天，無菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清，以細(xì)胞中和抗體效價(jià)檢測法檢測，確認(rèn)血清抗體為陽性且細(xì)胞中和抗體效價(jià)在1：256以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述中和抗體效價(jià)的測定方法如下：
S1： 將采集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清在56℃下滅活30min，然后用維持液對血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，每個(gè)稀釋度的血清分別與豬流行性腹瀉病毒抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)VERO細(xì)胞生長24小時(shí)以上，細(xì)胞密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.1mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對照細(xì)胞6孔；
S3：將細(xì)胞板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為豚鼠或兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟1）的免疫為多點(diǎn)免疫，所述多點(diǎn)免疫為2點(diǎn)、3點(diǎn)或4點(diǎn)免疫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟2) 無菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的具體操作為：采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無菌環(huán)境下分離血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的維持液為DMEM維持液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的豬流行性腹瀉病毒抗原的濃度為200TCID50/0.1mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求21述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的倍比稀釋，稀釋至血清與維持液的比例1:256以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1每個(gè)稀釋度的血清與豬流行性腹瀉病毒抗原等量混合。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述細(xì)胞板為96孔細(xì)胞板。
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