[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710016843.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106699881A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設計）人: 詹先強;陳晟生;陳樨;賴婷婷;陳景容;姚堯;元麗花;賴道華;黃玉婷
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 福州君誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司35211
• 代理人: 張耕祥

1.一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：其包括以下步驟：

1) 篩選豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性的動物作為實驗動物，對每只實驗動物進行免疫接種：

用豬流行性腹瀉病毒抗原進行基礎免疫：對每只實驗動物皮下或肌肉注射0.5-2mL豬流行性腹瀉病毒抗原進行基礎免疫；

用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進行3-5次免疫：基礎免疫7--10天后對每只實驗動物進行皮下或肌肉注射豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進行3-5次免疫接種，每次免疫接種的時間間隔為7-10天，第1次接種量為1-3頭份，以后每次接種量比上一次增加2-3頭份或者做倍增接種；

2）最后一次免疫后28-42天，無菌采集實驗動物血清，以細胞中和抗體效價檢測法檢測，確認血清抗體為陽性且細胞中和抗體效價在1：256以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述中和抗體效價的測定方法如下：

S1： 將采集的實驗動物血清在56℃下滅活30min，然后用維持液對血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，每個稀釋度的血清分別與豬流行性腹瀉病毒抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；

S2：用細胞板培養(yǎng)VERO細胞，當VERO細胞生長24小時以上，細胞密度達到致密單層時，棄去培養(yǎng)液，取0.1mL上述中和液接種于細胞板上，每個稀釋度的血清中和液分別接種6孔細胞，同時設不中和的病毒陽性對照細胞6孔和接種維持液的陰性對照細胞6孔；

S3：將細胞板置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細胞病變情況，以細胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述實驗動物為豚鼠或兔。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟1）的免疫為多點免疫，所述多點免疫為2點、3點或4點免疫。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟2) 無菌采集實驗動物血清的具體操作為：采集實驗動物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無菌環(huán)境下分離血清。

6.根據(jù)權(quán)利要求2的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的維持液為DMEM維持液。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的豬流行性腹瀉病毒抗原的濃度為200TCID₅₀/0.1mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求21述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1的倍比稀釋，稀釋至血清與維持液的比例1:256以上。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述步驟S1每個稀釋度的血清與豬流行性腹瀉病毒抗原等量混合。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，其特征在于：所述細胞板為96孔細胞板。