[發明專利]一種對超薄細胞的高精度軸向定位與成像方法與裝置

有效

• 申請號: 201710015726.6
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106841136B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 匡翠方;鄭程;黃玉佳;劉旭;劉向東
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N15/10
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種對超薄細胞的高精度軸向定位與成像方法，通過將細胞的上下表面分為兩個部分，分別對這兩個部分進行不同方式的多角度照明得到與軸向位置相對應的熒光光強信息，再結合相應算法得到細胞內熒光顆粒的軸向信息，獲取三維圖像。本發明還公開了一種對超薄細胞的高精度軸向定位與成像裝置，照明光通過1/4波片和二維掃描振鏡系統在樣品表面進行環狀掃描同時改變入射角度，產生兩種不同的照明方式，激發出熒光被CCD接收；結合收到的熒光強度與樣品軸向位置之間的關系就可以實現對超薄細胞的高精度軸向定位。本發明裝置簡單，操作方便；利用激發光的不同入射角度對整個細胞的上部分和下部分都進行了高精度的定位和成像。

技術領域

本發明屬于顯微成像領域，尤其涉及一種結合旋轉全內反射顯微和干涉對比顯微實現對超薄細胞的高精度軸向定位和三維成像的方法與裝置。

背景技術

生物科學研究的發展使得對生物現象的觀察趨向于更精確，即要求更高的分辨率。在傳統的顯微方法中，照明的時整個視場在在z軸方向上都被照明光束照明，z軸方向的分辨率和信噪比一直都做不高，因此需要一種僅觀察超薄層樣品結構的顯微方法有，尤其是在一些與膜相關的生物現象的研究中。

統的一些提高z軸分辨率的技術手段包括光切片(Lightsheet)顯微鏡和全內反射顯微鏡(Tirf)。Lightsheet采用橫向照明的方式，但由于衍射極限的存在橫向照明的最細光束只能做到半波長量級，其z軸分辨率依然達不到僅觀察細胞膜結構的要求，而且由于細胞的貼壁生長，光切片顯微技術很難準確照明到相應的位置。Tirf利用全內反射產生的倏逝場沿z軸方向的衰減特性，通過改變全內反射的入射角度實現不同的衰減系數，從而在細胞與裝在波片之間形成100nm厚的光場，這層光場恰好與細胞的貼壁生長時細胞膜的位置重合，實現了細胞膜的準確照明。由于激光散斑的存在會導致光場不均勻，因此產生了一種通過旋轉照明均勻光場消除散斑的方法，即旋轉全內反射顯微鏡(Ring-tirf)。

但這種方法的穿透深度最多為幾百納米，成像范圍局限于細胞的下表面，無法對一個細胞進行完整成像，因此需要出現一種對細胞的上表面進行照明的方法。

發明內容

本發明提供了一種對超薄細胞的高精度軸向定位與成像方法與裝置，可以利用全內反射和干涉照明方法實現對超薄細胞的高精度軸向定位與成像。該種方法和裝置具有成像速度快、裝置簡單、操作方便等特點，可以很好地應用于熒光樣品的檢測之中。

一種對超薄細胞的高精度軸向定位與成像方法，包括以下步驟：

1)將激光器發出的激光光束進行準直；

2)對光束進行相應的偏振調制使其能夠形成目標照明圖案；

3)將調制后的光束通過二維掃描振鏡系統和顯微物鏡聚焦到樣品表面，實現在樣品表面上的環形掃描和變角度掃描；

4)在二維掃描過程中收集所述待測樣品各掃描點發出的信號光；

5)細胞下表面由入射角大于全內反射臨界角的光全內反射產生的倏逝波照明，產生的熒光強度為：

其中θ為入射角，z為軸向深度，α為激發光的入射角，為激發光的方位角，I代表電場強度，ρ為考慮到發散角的激光光束強度的空間分布，Ω為光束的發散角，f為軸向的熒光分子強度。

考慮到有限的入射角和穿透深度，可以得到：

g＝Hf

其中g和f分別對應N個角度和N個深度的向量，H為N角度和N深度的信息組成的矩陣，與上述的算符均相關。因此可以將成像過程看做一個線性系統，通過求解逆問題的方式，從多角度圖像中重建出細胞的三維熒光密度分布。

6)細胞上表面由入射角小于全內反射臨界角的透射光與反射光干涉產生的圖案照明，干涉產生的照明圖案強度分布滿足公式：