[發(fā)明專利]一種對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像方法與裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710015726.6
• 申請(qǐng)日: 2017-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN106841136B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡翠方;鄭程;黃玉佳;劉旭;劉向東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N15/10
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于：

針對(duì)細(xì)胞的下表面，由入射角大于全內(nèi)反射臨界角的光產(chǎn)生的倏逝波進(jìn)行照明；激發(fā)的倏逝波場沿著z軸發(fā)生指數(shù)衰減，對(duì)細(xì)胞的下表面照明激發(fā)熒光，通過改變照明角度改變衰減系數(shù)，實(shí)現(xiàn)z軸的差別照明，通過求解逆問題的方式，從多角度圖像中重建出細(xì)胞下表面的三維熒光密度分布；

針對(duì)細(xì)胞的上表面，由入射角度小于全內(nèi)反射臨界角透射光和其被細(xì)胞上表面附近反射一次后的反射光干涉產(chǎn)生的圖案進(jìn)行照明；改變角度同樣得到不同深度的熒光顆粒對(duì)應(yīng)不同入射角度時(shí)被激發(fā)的熒光強(qiáng)度，通過求解逆問題的方式，得到細(xì)胞上表面的三維熒光密度分布；

根據(jù)采集到上表面和下表面產(chǎn)生的熒光光強(qiáng)信息，進(jìn)行細(xì)胞的軸向定位與三維成像。

2.如權(quán)利要求1所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，當(dāng)入射角度θ₁大于全反射角時(shí)，激發(fā)的倏逝波場沿著z軸發(fā)生指數(shù)衰減，對(duì)細(xì)胞的下表面照明激發(fā)熒光，通過改變照明角度改變衰減系數(shù)，實(shí)現(xiàn)z軸的差別照明和樣品的三維成像。

3.如權(quán)利要求2所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，產(chǎn)生全內(nèi)反射時(shí)，得到的圖像為橫向各位置光強(qiáng)軸向積分，其分布滿足公式：

其中I(0,θ_i)為載玻片表面的電場強(qiáng)度，φ為探測(cè)器和熒光顆粒的量子效率，Q(z)和PSF(z)為光子收集效率和系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，C(z)為熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品，z為離界面的軸向距離，d_p為穿透深度，θ_i為全內(nèi)反射的激發(fā)角，n_i和n_t分別為蓋玻片和樣品的折射率。

4.如權(quán)利要求1所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，細(xì)胞上表面附近設(shè)置反射用的蓋玻片。

5.如權(quán)利要求4所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，所述蓋玻片的表面與細(xì)胞之間依次鍍?cè)O(shè)用于增強(qiáng)反射效應(yīng)的硅膜和二氧化硅膜。

6.如權(quán)利要求1所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，干涉產(chǎn)生的照明圖案強(qiáng)度分布滿足公式：

E～1+r^TEexp[iφ(H)]，

其中r^TE是與界面垂直的電場分量的菲涅爾反射系數(shù)，φ(H)是透射光與反射光之間的相位差；

與軸向位置H相關(guān)的φ(H)滿足公式：

菲涅爾系數(shù)滿足公式：

p₀＝n_Si cosθ_Si，p₁＝n_ox cosθ_ox，p₂＝n_b cosθ_b，

其中，λ為入射光真空中的波長，為特征矩陣M_TE的四個(gè)參數(shù)，k_i為不同材料中的波矢；n_Si，n_ox，n_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的折射率；θ_Si，θ_ox，θ_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的入射光角度；d_ox為二氧化硅膜層的厚度。

7.如權(quán)利要求1所述的高精度軸向定位與成像方法，其特征在于，采集熒光光強(qiáng)信息時(shí)，保持入射角度不變?cè)陲@微物鏡的后焦面上進(jìn)行環(huán)形掃描，用于消除激光照明產(chǎn)生的散斑。