[發(fā)明專利]一種制備鮭魚降鈣素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710015213.5
• 申請(qǐng)日: 2017-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN107699588B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉昱輝;李梅;賈士榮;王志興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/62;C07K14/585
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;何葉喧

本發(fā)明公開了一種制備鮭魚降鈣素的方法。本發(fā)明所提供的方法，依次包括如下步驟：(1)將含有表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述表達(dá)盒自上游至下游依次包括如下元件：植物種子特異表達(dá)蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因和終止序列；所述融合基因包括編碼蛋白標(biāo)簽的區(qū)段丙、甲酸的識(shí)別序列和編碼鮭魚降鈣素的前體的核酸分子；(2)取轉(zhuǎn)基因植物的種子，脫脂后提取粗蛋白；(3)利用所述蛋白標(biāo)簽從所述油體中純化所述融合蛋白；(4)用甲酸進(jìn)行切割；(5)分離鮭魚降鈣素；(6)醋酸化；(7)脫鹽。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的方法可以得到生物學(xué)活性較高的鮭魚降鈣素。因此，本發(fā)明提供的方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備鮭魚降鈣素的方法。

背景技術(shù)

鮭魚降鈣素是由鮭魚后腮體分泌的由32個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。鮭魚降鈣素作為治療骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨病的防治藥已被載入多國藥典，并已在多國行銷近30年。鮭魚降鈣素具有調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷代謝及骨骼代謝的重要生物學(xué)功能，可降低血鈣水平，還具有抗組胺、抗膽堿、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。臨床上主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。鮭魚降鈣素的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)合成法和基因工程法。提取法是以鮭魚、鰻魚的鰓為原料，提取獲得天然鮭魚降鈣素(生物學(xué)活性達(dá)到4500U/mg)，但由于原料有限，因此獲得的天然鮭魚降鈣素極少?；蚬こ谭ㄊ窃诖竽c桿菌或酵母中表達(dá)鮭魚降鈣素，但由于鮭魚降鈣素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表達(dá)出的鮭魚降鈣素的生物學(xué)活性，僅為100-200U/mg。迄今為止，商業(yè)化銷售的鮭魚降鈣素都是采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的，化學(xué)合成法步驟多、得率低且價(jià)格昂貴，注射針劑中的鮭魚降鈣素為12000元/mg，原藥價(jià)格也高達(dá)18000-20000元/g。如何制備生物學(xué)活性較高的鮭魚降鈣素是一個(gè)亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制備鮭魚降鈣素。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備鮭魚降鈣素的方法。

本發(fā)明所提供的制備鮭魚降鈣素的方法，依次可包括如下步驟：

(1)將含有表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)融合蛋白；所述表達(dá)盒自上游至下游依次包括如下元件：植物種子特異表達(dá)蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因和終止序列；

所述融合基因中可含有區(qū)段丙、區(qū)段丁和區(qū)段乙；所述區(qū)段丙編碼蛋白標(biāo)簽；所述區(qū)段丁為切割物質(zhì)的識(shí)別序列；所述區(qū)段乙編碼鮭魚降鈣素的前體；所述鮭魚降鈣素的前體為氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白質(zhì)；

(2)取轉(zhuǎn)基因植物的種子，脫脂后提取粗蛋白；

(3)利用所述蛋白標(biāo)簽從所述粗蛋白中純化所述融合蛋白；

(4)取步驟(3)得到的融合蛋白，用切割物質(zhì)進(jìn)行切割；

(5)從步驟(4)的產(chǎn)物中分離鮭魚降鈣素；

(6)醋酸化；

(7)脫鹽。

所述融合基因中，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子，中間為連續(xù)的編碼區(qū)。

所述鮭魚降鈣素的前體在植物體內(nèi)可自發(fā)形成鮭魚降鈣素。

所述區(qū)段乙可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列4自5′末端起第34至132位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列4自5′末端起第34至132位所示的DNA分子；

b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且編碼所述鮭魚降鈣素的前體的DNA分子；