[發明專利]一種制備鮭魚降鈣素的方法

有效

• 申請號: 201710015213.5
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN107699588B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 劉昱輝;李梅;賈士榮;王志興
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/62;C07K14/585
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;何葉喧

1.一種制備鮭魚降鈣素的方法，依次包括如下步驟：

（1）將含有表達盒的重組載體導入受體植物，得到轉基因植物；轉基因植物中表達融合蛋白；所述表達盒自上游至下游依次包括如下元件：植物種子特異表達蛋白基因的啟動子、融合基因和終止序列；所述植物種子特異表達蛋白基因的啟動子為菜豆儲存蛋白基因的啟動子；

所述融合基因中含有區段丙、區段丁和區段乙；所述區段丙編碼蛋白標簽；所述蛋白標簽為6×His標簽；所述區段丁為切割物質的識別序列；所述區段乙編碼鮭魚降鈣素的前體；所述鮭魚降鈣素的前體為氨基酸序列如序列表中序列6自N末端起第623至655位所示的蛋白質；鮭魚降鈣素的前體的編碼基因為序列表中序列4自5′末端起第34至132位所示；

（2）取轉基因植物的種子，脫脂后提取粗蛋白；

（3）利用所述蛋白標簽從所述粗蛋白中純化所述融合蛋白；

（4）取步驟（3）得到的融合蛋白，用切割物質進行切割；

（5）從步驟（4）的產物中分離鮭魚降鈣素；

（6）醋酸化；

（7）脫鹽；

所述受體植物為油菜品種中雙4號。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）中，所述融合基因還包括區段甲；所述區段甲編碼篩選標記蛋白。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（2）中，所述“脫脂”的步驟為：先粉碎轉基因植物的種子，然后用正己烷脫脂； 所述“提取粗蛋白”為用含8-12mg/mL蔗糖和1.5-2.5mg/mL SDS的pH6.5-7.0、0.1-0.3M Tris-Hcl緩沖液進行提取。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）和步驟（4）中，所述切割物質為滿足如下條件的切割物質：所述切割物質對于所述融合基因的表達產物的酶切位置為特定氨基酸殘基與其前一位氨基酸殘基之間；所述特定氨基酸殘基為所述鮭魚降鈣素的前體的第一個氨基酸殘基。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（5）中，所述“分離鮭魚降鈣素”采用陽離子交換層析進行分離。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（6）中，所述醋酸化的步驟為：調節步驟（5）分離的鮭魚降鈣素的pH值至1.0-3.0，然后加入醋酸鈉處理40-80min。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（7）中，所述脫鹽為反相色譜脫鹽。

8.如權利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：完成步驟（7）后，還包括凍干的步驟。