[發明專利]一種納豆激酶的轉基因方法

在審

• 申請號: 201710014720.7
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106755017A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 程佳祎;王躍駒
• 申請（專利權）人: 程佳祎;王躍駒
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 李進

技術領域

本發明涉及植物育種技術領域，具體而言，涉及一種納豆激酶的轉基因方法。

背景技術

納豆激酶(nattokinase簡稱NK)是從日本食品中納豆提取和純化的酶(EC 3.4.21.62)。在中國得到豆豉當中也含有納豆激酶。Nattō是從發酵大豆制成的，通過將細菌納豆芽孢桿菌加入到煮沸的大豆中通過發酵產生。并且作為傳統食品已經安全使用了幾千年。納豆激酶由作用于大豆的細菌產生。盡管其名稱為激酶，但納豆激酶不是激酶，而是枯草桿菌蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶。它表現出很強的纖維蛋白溶解活性【1】。

納豆激酶由于其存在于食物當中，可以由胃腸道吸收。納豆激酶的體外、體內溶栓性，以及動物和臨床試驗已經證明其具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循環，軟化和增加血管彈性等作用。在體內作用迅速、持續時間長，還能激活體內的tPA，使之溫和、持續地提高血液的纖溶活性【1】。口服納豆激酶膠囊可以可以預防心血管疾病，中風，以及老年癡呆。在一個病例中，每天連續服用阿司匹林和400mg的納豆激酶連續7天以預防中風的患者出現急性腦出血【2】。目前納豆激酶在亞洲，歐洲，以及美洲都可以買到。

納豆激酶由aprN基因編，其首先從枯草芽孢桿菌納豆中克隆并由Nakamura等人測序(1992)【3】。全長多肽含有29個殘基的信號肽，其有助于蛋白質從細胞膜分泌出來，77個殘基的前肽，在蛋白質折疊過程中作為分子內伴侶起關鍵作用。成熟的納豆激酶由275個氨基酸按照固定排列方式組成，分子量是27kDa。納豆提取的納豆激酶被認為是安全，溶栓強，低成本，預防治療心臟和心血管疾病，幫助血液循環系統的最佳膳食補充劑。傳統的納豆發酵過程簡單直接，可以在家里做。將煮熟的大豆用納豆芽孢桿菌接種并在室溫下孵育一天進行發酵，直到豆用粘性和粘性物質谷氨酸聚合物覆蓋。納豆工業生產是優化發酵條件，包括最佳溫度，pH和調節發酵時間，以增加NK產量。納豆可以在pH 6～12下保持活性，耐高達60℃的高溫，它在60℃以上失去活性【1】。目前市售的NK產品在室溫下保持活性至少6個月。

目前，納豆在日本以外的地方均以膠囊形式被消費。與簡單的發酵過程相比，從納豆漿中提取和純化納豆是復雜且低效的。更多的操作單位涉及有機溶劑均化，鹽析，蛋白質離子交換和透析等，這些冗長的過程減少納豆產量以及降低其活性，最終產品中過量的副產物也可能導致過敏。為了增加納豆的產量和簡化其下游純化過程，越來越多的科研人員利用基因工程重組技術來生產納豆激酶。大腸桿菌(Escherichia coli)的最簡單和最便宜的宿主系統已被廣泛用于重組納豆激酶的生產。雖然納豆激酶可以在大腸桿菌中表達，但是大量的重組蛋白聚集在一起，導致產生不溶性，無活性包涵體【4】。大多數蛋白質在包涵體溶解和再折疊期間損失，而且重組納豆激酶的纖維蛋白溶解活性遠低于從納豆分離的NK。枯草芽孢桿菌是另一種有吸引力的表達宿主，因為它具有產生分泌蛋白的能力。Wu等人(2011)改變納豆激酶(PaprN)啟動子的-10元素(TACAAT)為共識-10區(TATAAT)，成功增強納豆激酶在重組枯草芽孢桿菌(643mg/L)中的表達【5】。然而，枯草芽孢桿菌本身產生大量天然蛋白酶，可以水解重組蛋白。真核表達系統也已經應用于納豆激酶的產生。Li等(2007)修改了桿狀病毒表達系統，在昆蟲細胞中表達可溶性，具有高度活性的納豆激酶【6】。然而，使用昆蟲細胞生產納豆激酶成本太高，不具有實用性。相比較于大腸桿菌系統，酵母能夠對重組擔保進行翻譯后修飾，并具有折疊重組蛋白的機制。巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)具有在發酵培養中生長高密度和產生大量重組蛋白的優點。Luo等人(2003)【7】報道在巴斯德畢赤酵母中表達納豆激酶并檢測纖維蛋白溶解活性。但是因為巴斯德畢赤酵母需要利用甲醇來誘導表達，殘留的甲醇對人體非常有害。所以利用酵母表達納豆激酶沒有繼續研究。