[發明專利]焦磷酸測序法檢測TERT啟動子突變試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710013157.1
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN108285922A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 李智;唐新月;石峰
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏;周棟

本發明公開了一種焦磷酸測序法檢測檢測TERT啟動子突變的試劑盒及方法。所述TERT啟動子突變具體的是指啟動子上游?124bp 1295,228C>T和?146bp 1259,250C>T突變。試劑盒包含：PCR緩沖溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、焦磷酸測序試劑盒、磁珠、結合緩沖溶液、洗滌緩沖溶液、退火緩沖溶液和變性緩沖溶液。本發明的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量TERT啟動子突變的檢測，從而達到對甲狀腺癌早期診斷篩查提供依據。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測TERT啟動子突變的試劑盒及方法。

背景技術

端粒(telomere)是線性染色體末端的一小段核蛋白結構，它通過防止DNA融合和退化保持基因組的穩定性。在正常細胞中，端粒隨著細胞有絲分裂而逐漸縮短，從而調節細胞的衰老與凋亡。但在癌細胞中，端粒酶被激活而持續表達，維持端粒的長度，使腫瘤細胞得到永生。端粒酶是一種核糖核蛋白，它以自身RNA為模板合成端粒DNA，添加到染色體末端，延長端粒。端粒酶在多種腫瘤細胞中高表達，對癌細胞的增殖分化起重要作用，抑制端粒酶活性，能夠抑制腫瘤細胞的生長。端粒酶逆轉錄酶(telomerase reversetranscriptase,TERT)是端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活性的主要限制因子。與端粒酶RNA亞單位相比，TERT在端粒酶的活性中起更重要的作用。2013年Horns在黑色素瘤中發現了TERT啟動子突變，隨后，TERT啟動子突變在膀胱癌，惡性膠質瘤以及甲狀腺癌中相繼被發現。其在中樞神經系統，膀胱癌，分化型甲狀腺癌及皮膚癌中的發生率分別為43％，59％，10％，29％。TERT^C228T/C250T突變與多種癌癥的發生，年齡，性別，腫瘤大小，侵襲及轉移復發及死亡均有一定的相關性。因此TERT啟動子突變被認為是致癌突變。TERT啟動子最常見的兩個突變位于5號染色體1 295 228C>T(C228T)和1 295 250C>T(C250T)，分別對應于TERT轉錄起始位點上游124bp和146bp處。該突變位于TERT啟動子區可影響TERT的活性，繼而影響端粒酶的功能，從而促進癌癥細胞的永生，導致病情惡性程度增加，治療難度加大及預后不良。

綜上TERT^C228T突變可作為提示癌癥發生及預后的重要分子標志物，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測TERT^C228T突變的試劑盒將為癌癥的早期診斷篩查及個體化治療起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

TERT啟動子突變具體的是指啟動子上游-124bp 1295,228C>T和-146bp 1259,250C>T突變，TERT^C228T/C250T突變是癌癥發生的重要分子標志物。本發明提供一種檢測TERT啟動子突變的試劑盒，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的癌癥早期診斷篩查。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

所述焦磷酸測序法檢測TERT啟動子(TERT^C228T/C250T)突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如下引物：

TERT上游引物5′-CACAGACGCCCAGGACCG-3′(SEQ ID NO.1)；

TERT下游引物5′-GCGCTGCCTGAAACTCGC-3′(SEQ ID NO.2)，下游引物的5′端進行生物素標記；

TERT測序引物5′-CCCGCCCCGTCCCGA-3′(SEQ ID NO.3)。