[發明專利]一種提高極低拷貝數目標DNA檢測靈敏度的方法

在審

• 申請號: 201710012297.7
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106755455A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 梁興國;潘孝明;王鵬飛
• 申請（專利權）人: 青島千卓分子生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司37241
• 代理人: 趙翠

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及一種提高現有核酸檢測技術對極低拷貝數目標DNA檢測靈敏度的方法。

背景技術

基于體外DNA擴增技術的核酸檢測方法具有高靈敏度與高特異性的優點，比較具有代表性的是PCR(變溫反應)以及環介導等溫擴增(LAMP)，在生物學、醫學、環境科學、法醫學、食品科學等領域發揮著極其重要的作用。在食品安全檢測領域，傳統的微生物培養鑒定法需要數天檢測周期，而核酸檢測方法在幾小時內便可完成，且靈敏度與特異性均高于傳統方法；在醫學領域核酸檢測方法被廣泛應用于多種疾病的快速準確檢測以及藥物研發等多種項目中；在法醫學中DNA檢測是偵辦各類刑事案件的重要手段。

但是核酸檢測法高靈敏度結果的獲得往往需要在使用較為理想的樣品的條件下獲得，相對于一些目標DNA數量極低(或極微量目標DNA混雜于大量背景核酸中)的樣品，核酸檢測方法的靈敏度與特異性可能降低從而導致假陰性或假陽性的結果，如醫學檢測中“分析”靈敏度與“臨床”靈敏度不一致的情況。為此，針對這一類樣品進行純化以消除大量背景核酸的影響成為提高這類樣品檢測效率的方法之一，如美國專利US 13/933,919(Richmond et al,2013)公開了一種利用陰離子交換技術從大量背景核酸中選擇性富集特定片段長度DNA的方法，但該方法適用于較大量樣品的純化且需要制備特定的陰離子交換微珠，極低數量的目標DNA容易在吸附和洗脫過程中丟失；Zhou等報道了一種特異性去除人基因組DNA從而提高血液樣品中沙門氏菌檢測靈敏度的方法，其先使用牛膽汁和微球菌核酸酶將人基因組DNA降解后再單獨提取沙門氏菌DNA進行檢測，但此方法只適合于全血樣品的處理且操作過程相對較為繁瑣(Zhou L,Pollard A J.A novel method of selective removal of human DNA improves PCR sensitivity for detection of Salmonella Typhi in blood samples[J].BMC infectious diseases,2012,12(1):164.)。針對不含背景核酸的純DNA樣品，雖然PCR法可以達到理論上1拷貝的檢測靈敏度，但由于需要極其嚴格的實驗環境以及最優的實驗條件(引物、試劑、參數等)，因此實際操作中因很難達到這一目標，很多文獻報道中PCR的檢測閾值約為100拷貝甚至更多(王怡倩，葉長蕓.建立檢測產氣腸桿菌的TaqMan熒光定量PCR和普通PCR方法[J].疾病監測,2016,31(2):153-158；Sritunyalucksana K,Srisala J,McColl K,et al.Comparison of PCR testing methods for white spot syndrome virus(WSSV)infections in penaeid shrimp[J].Aquaculture,2006,255(1):95-104.)，增加擴增循環數雖可一定程度上提高檢測靈敏度但同時增加了假陽性風險。

顯然，如果研發一種成本低廉、操作簡便、對實驗設備等要求低的方法可以提高極低豐度(低于百萬分之一)DNA的檢測靈敏度，同時保證檢測的高特異性，將有效提高核酸檢測方法在各種實際復雜情況下檢測的效率，應用前景廣闊。

發明內容

針對上述問題，本發明旨在提供一種高效、簡便的可以提高現有核酸檢測靈敏度的方法，使極低數量的目標DNA可被高靈敏度、高特異性檢出。

一種提高極低拷貝數目標DNA檢測靈敏度的方法，主要步驟如下：向待檢測樣品DNA中加入外源背景基因組DNA；使用特定的可以對目標DNA切割產生隨機堿基粘性末端的限制性內切酶對混合后的樣品DNA進行酶切；根據目標DNA切割后所產生的粘性末端設計與之互補的接頭并與之進行連接；使用接頭中含有的通用引物對連接產物進行PCR反應；以PCR產物為模板，使用針對目標DNA設計的特異性引物進行特異性核酸擴增檢測。

更具體的步驟為：

a)向待檢測樣品DNA中加入終濃度為10-500ng/μL的外源背景基因組DNA；

b)使用可以對目標DNA切割產生隨機堿基粘性末端的限制性內切酶對步驟a)得到的樣品進行酶切，酶切反應參數由所選內切酶確定；

c)向酶切產物中加入針對目的基因酶切片段設計的雙鏈DNA接頭，并在DNA連接酶的作用下進行連接反應，使酶切片段的兩端均連接上接頭，所述接頭上均帶有通用引物序列，接頭最終濃度為50-400nM，連接反應參數根據所選連接酶確定；