[發明專利]一種提高極低拷貝數目標DNA檢測靈敏度的方法

在審

• 申請號: 201710012297.7
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106755455A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 梁興國;潘孝明;王鵬飛
• 申請（專利權）人: 青島千卓分子生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司37241
• 代理人: 趙翠

1.一種提高極低拷貝數目標DNA檢測靈敏度的方法，其特征在于，主要步驟如下：向待檢測樣品DNA中加入外源背景基因組DNA；使用特定的可以對目標DNA切割產生隨機堿基粘性末端的限制性內切酶對混合后的樣品DNA進行酶切；根據目標DNA切割后所產生的粘性末端設計與之互補的接頭并與之進行連接；使用接頭中含有的通用引物對連接產物進行PCR反應；以PCR產物為模板，使用針對目標DNA設計的特異性引物進行特異性核酸擴增檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟為：

a)向待檢測樣品DNA中加入終濃度為10-500ng/μL的外源背景基因組DNA；

b)使用可以對目標DNA切割產生隨機堿基粘性末端的限制性內切酶對步驟a)得到的樣品進行酶切，酶切反應參數由所選內切酶確定；

c)向酶切產物中加入針對目的基因酶切片段設計的雙鏈DNA接頭，并在DNA連接酶的作用下進行連接反應，使酶切片段的兩端均連接上接頭，所述接頭上均帶有通用引物序列，接頭最終濃度為50-400nM，連接反應參數根據所選連接酶確定；

d)以連接產物為模板，使用通用引物進行PCR反應，反應參數根據最終目標片段長度確定；

e)以上一步PCR反應產物為模板，使用目標DNA的特異性引物進行PCR、LAMP或RCA對目標基因的最終檢測，反應條件及參數根據所選特異性檢測方法確定。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟a)所述外源背景基因組DNA包括所有真核生物的基因組DNA。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟a)所述外源背景基因組DNA為鮭魚精DNA。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟b)中所述限制性內切酶是一類可以對目標DNA切割產生隨機堿基粘性末端的內切酶，選擇識別位點為4-6堿基、產生的粘性末端長度為4-9堿基內切酶，且所選內切酶應至少在目標基因中含有兩個酶切位點或使用兩種在目標基因中各含有一個酶切位點的內切酶。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c)中所述接頭由兩條長度不同的單鏈DNA組成，其中長鏈部分5’端含有一段通用引物序列，短鏈部分5’端含有可與目標基因酶切片段粘性末端完全互補配對的“銜接”序列，長鏈與短鏈之間含有≥8堿基的互補配對部分。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述限制性內切酶包括Alw26I，BbvI，FokI，HgaI，TspRI。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟c)中所述DNA連接酶主要包括T3、T4、T7 DNA連接酶以及E.coli DNA連接酶和Taq DNA連接酶，所述DNA連接酶的連接時間為0.5-2.5h。

9.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟d)中所述通用引物指的是一段寡核苷酸序列，同時也是所有雙鏈DNA接頭的長鏈部分，長度為18-26個堿基，熔點為60℃±5℃，通用引物在PCR體系中的濃度為0.1-1μM。

10.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟e)中所述特異性引物為針對目標酶切片段所設計，擴增產物為目標片段內部的一段DNA序列。