[發明專利]丙酮酸工業量產發酵工藝

在審

• 申請號: 201710012209.3
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106834364A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 許友民;馬輝;石光東
• 申請（專利權）人: 通遼市黃河龍生物工程有限公司
• 主分類號: C12P7/40
• 分類號: C12P7/40;C12N1/16;C12R1/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其涉及一種適用于一百五十立方的大型發酵罐的丙酮酸工業量產發酵工藝。

背景技術

丙酮酸作為重要的有機酸之一，又稱2-氧化丙酸、α-酮基丙酸或乙酰基甲酸，為無色至淡黃色液體，呈醋酸香氣和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且是合成多種有用化合物的前體，因此，它在制藥、日用化工、農用化學品和食品等工業及科學研究中有著廣泛的用途。

目前，相對于化學合成法生產的丙酮酸，發酵法生產丙酮酸具有成本低、高質量的優點；近些年，針對發酵法發酵丙酮酸工藝的研究隨之進行，研究多采用光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸；由于光滑球擬酵母屬的多重維生素營養缺陷型菌株是目前發酵法生產中最常用的和最具有競爭力的生產菌株，因此，采用發酵法生產丙酮酸在菌種、發酵條件優化等方面作為研發重點。

當前，針對光滑球擬酵母發酵生丙酮酸提供了如下參考文獻：

(1)、2003年第23期《精細與專用化學品》.光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸.劉立明等；

(2)、《生物工程報》第16卷2期.營養條件對光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸的影響.2000.3.李寅等；

(3)、2012年第31卷第4期《中國釀造》.光滑球擬酵母適應進化改善丙酮酸生產.趙博等；如上參考文獻中存在一定的技術缺陷：第一、發酵周期較長、產率低；第二、針對發酵現實中出現的丙酮酸的降解或者轉化問題，沒有進行有效解決；第三、中試與大生產一百五十立方的大型發酵罐在發酵工藝參數的變化不同，工藝控制點的范圍也不同，進而實現工業量產。

發明內容

本發明的目的是為克服現有技術的不足，提供了一種適用于一百五十立方的大型發酵罐的丙酮酸工業量產發酵工藝，該工藝發酵周期短、產率高、能較好抑制發酵過程中菌種對飽和的丙酮酸的降解或者轉化問題。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

丙酮酸工業量產發酵工藝，具體工藝步驟如下：

(1)平板培養：

A.平板培養基(g/L)：葡糖糖漿3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨瓊脂3-4、碳酸鈣0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min滅菌備用；

B.光滑球擬酵母于平板培養基內，平板倒置培養皿中28℃-30℃培養，培養時間15h-20h后；

(2)茄瓶培養：

a.茄瓶培養基(g/L)：葡糖糖漿13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨瓊脂10-12、碳酸鈣2-2.5、氯化銨0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min滅菌備用；

b.在無菌室內嚴格按無菌操作，從保存平板上挑單菌落涂布在茄瓶固體培養基上；

c.培養條件：28℃-30℃，培養時間15h-20h后；

d.將茄瓶放置1℃-4℃的冰箱內存儲備用；

(3)種子搖瓶培養：

I.搖瓶培養基(g/L)：葡糖糖漿17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸鈣2.5-4.5、氯化銨0.5-0.8、氯化鎂0.32-0.48、磷酸氫二鉀0.2-0.4、原水溶解并用濃度為1.5mol/L HCL調節培養基初始PH為5-6，121℃-124℃15min滅菌備用；

II.3000ml或5000ml的三角瓶或鋼瓶二十至三十個，在無菌室內用滅過菌的接種鏟，從培養好的茄瓶內鏟取菌臺接到500ml的三角瓶或鋼瓶中；接種量為600ml/瓶-1000ml/瓶；培養溫度為28℃-30℃，培養時間22h-24h；

(4)一級種子培養：

①一級種子培養基(g/L)：葡糖糖漿20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸鈣6.5-8.5、氯化銨1.5-2.8、氯化鎂1.32-3.48、磷酸氫二鉀1.2-2.4、原水溶解并用濃度為1.5mol/L HCL調節培養基初始PH為5-6，121℃-124℃15min滅菌備用；

②采用800L種子罐3-5個；種子搖瓶的合拼至三角鋼瓶內，在無菌環境下對種子罐進行接種操作，接種量為2000ml/罐-3000ml/罐；

③培養條件：培養溫度28℃-30℃，1-6h通氣量比1∶1，6h以后至種子成熟通氣量比：1∶4，罐壓維持在0.03MPa-0.05MPa；

④種子成熟的標準：OD值在40-50之間；

(5)發酵罐培養：