[發(fā)明專利]表達(dá)腸道M樣細(xì)胞靶向肽和豬流行性腹瀉病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710012140.4
• 申請日: 2017-01-03
• 公開（公告）號: CN108265073B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊倩;牟春曉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/65;C12N15/50;C12N15/31;C12N1/21;A61K49/00;C12R1/125
• 代理公司: 上海領(lǐng)譽(yù)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31383
• 代理人: 車超平

本發(fā)明涉及表達(dá)腸道M樣細(xì)胞靶向肽(L?lectin?β?GF)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S蛋白的重組枯草芽孢桿菌(B.S.?RCL)，屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明成功構(gòu)建了表達(dá)L?lectin?β?GF和PEDV S蛋白的重組枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒pHT43?RCL，并成功電擊轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800N菌株。經(jīng)Western?blot驗(yàn)證L?lectin?β?GF和PEDV S蛋白在重組枯草芽孢桿菌內(nèi)可以被成功表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn)證明該重組枯草芽孢桿菌可以有效的靶向腸道M樣細(xì)胞，口服免疫可以刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生更高水平的PEDV特異性免疫應(yīng)答水平。重組枯草芽孢桿菌(B.S.?RCL)有望開發(fā)成增強(qiáng)型黏膜免疫遞送載體并且開發(fā)成預(yù)防豬流行性腹瀉的基因工程口服疫苗。

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及表達(dá)腸道M樣細(xì)胞靶向肽L-lectin-β-GF和PEDV S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域。具體包括：腸道M樣細(xì)胞靶向肽L-lectin-β-GF和PEDVS蛋白的表達(dá)性質(zhì)粒pHT43-RCL的構(gòu)建，L-lectin-β-GF和PEDV S蛋白的表達(dá)與鑒定，重組枯草芽孢桿菌能夠有效的與腸道M樣細(xì)胞結(jié)合以及重組枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)小鼠機(jī)體黏膜免疫以及PEDV特異性免疫應(yīng)答水平的檢測。

二、背景技術(shù)

1口服黏膜免疫研究進(jìn)展

口服黏膜免疫方法簡便、安全，不僅在黏膜局部和其他黏膜組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可引起全身性體液免疫應(yīng)答，多年來受到國內(nèi)外免疫學(xué)家的密切關(guān)注。目前兒童廣泛口服的脊髓灰質(zhì)炎糖丸就是一個(gè)消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰質(zhì)炎口服疫苗的應(yīng)用，使全球小兒麻痹發(fā)病得到有效控制，為口服疫苗的研制與應(yīng)用起到了指導(dǎo)作用。但是在實(shí)踐中，口服疫苗經(jīng)過消化道時(shí)常受到消化液的降解，疫苗很容易被破壞，影響免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的應(yīng)用和推廣受到限制。近年來疫苗遞送系統(tǒng)成為研究傳染病防御領(lǐng)域新技術(shù)的熱點(diǎn)之一。尤其是細(xì)菌活載體疫苗因具有培養(yǎng)方便，外源基因容量大，刺激細(xì)胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)具有巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)菌載體疫苗是新興現(xiàn)代疫苗的重要發(fā)展方向，所謂細(xì)菌載體疫苗是將所需的編碼病原菌特異性抗原的DNA片段插入減毒的病原菌或者共生菌中，讓其表達(dá)所編碼的抗原，以期達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的目的。通過活菌載體遞送疫苗抗原不僅可刺激腸道局部免疫應(yīng)答，又可針對特異性抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，使機(jī)體可以獲得全面的保護(hù)力。

以前的研究表明一些減毒細(xì)菌可作為疫苗抗原的載體，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等。國外學(xué)者以減毒沙門氏菌為載體在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了lacZ基因、綠色熒光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。沙門氏菌為載體傳遞DNA疫苗還能存在潛在危險(xiǎn)性。首先，減毒細(xì)菌可能存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；其次，質(zhì)粒DNA可能會整合到宿主細(xì)胞基因組，從而引起調(diào)控細(xì)胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失控、體細(xì)胞癌變、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等一系列問題。此外，減毒細(xì)菌對一些老弱病殘個(gè)體可能有潛在致病性。因此，選擇理想的疫苗抗原載體是建立生物學(xué)新技術(shù)的關(guān)鍵。理想的輸送抗原的載體應(yīng)該是本身對機(jī)體既安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的微生物。

2枯草芽孢桿菌對黏膜免疫的影響

目前對黏膜抗原的細(xì)菌遞送載體已有廣泛研究?；罴?xì)菌載體的種類很多，應(yīng)用比較廣泛的包括兩類：一類為弱毒病原體能夠誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答，如沙門氏菌和李斯特菌，但這些減毒細(xì)菌作為載體傳遞疫苗存在潛在的危險(xiǎn)性，甚至是致病性。另一類是目前較為關(guān)注的安全無致病性的共生物種，如乳桿菌和枯草芽孢桿菌等益生菌。枯草芽孢桿菌作為一種安全的無致病性活細(xì)菌載體，是廣泛存在于土壤和植物中的優(yōu)勢生物種群，隸屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，其細(xì)胞呈直桿狀，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，單個(gè)，革蘭氏染色陽性，著色均勻，無莢膜，能運(yùn)動(dòng)?？莶輻U菌作為抗原的載體具有很多優(yōu)點(diǎn)：①是人類和動(dòng)物安全紀(jì)錄的益生菌和食品添加劑，②成本低廉、耐熱、抗干燥、便于運(yùn)輸和使用，③其遺傳性狀和細(xì)菌學(xué)水平都很容易操縱。因此，枯草芽孢桿菌非常適宜作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原遞送載體。