[發明專利]表達腸道M樣細胞靶向肽和豬流行性腹瀉病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌

有效

• 申請號: 201710012140.4
• 申請日: 2017-01-03
• 公開（公告）號: CN108265073B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 楊倩;牟春曉
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/65;C12N15/50;C12N15/31;C12N1/21;A61K49/00;C12R1/125
• 代理公司: 上海領譽知識產權代理有限公司 31383
• 代理人: 車超平

1.一種腸道M樣細胞靶向肽L-lectin-β-GF和PEDV S蛋白的重組表達質粒pHT43-RCL，其特征在于，所述重組表達質粒pHT43-RCL是由以下方法構建而成：

1.1紅色熒光蛋白基因的克隆

參照已發表的紅色熒光蛋白基因序列設計一對擴增紅色熒光蛋白基因RFP的引物，所述紅色熒光蛋白基因序列的GenBank登陸號為AB166761.1，在上游引物5’端引入與pHT43載體多克隆位點3’末端11bp的同源臂序列，兩序列之間引入BamHI酶切位點，其中下劃線為酶切位點；在下游引物5’端引入與豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因5’末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入BamHI酶切位點，其中下劃線為酶切位點，引物序列如下：

P1:CATCARCCGTAGGATCC AGTAAAGGAGAAGAA，序列編號為SEQ ID NO.4；

P2:AACAAAAGAAATGGATCC TTTGTATAGTTCATCCAT，序列編號為SEQ ID NO.5；

以pDsRed-monomer-N1質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，72℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min；將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-R，測序后獲得具有完整編碼區的紅色熒光蛋白基因序列SEQ ID NO.1；

1.2豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因的克隆

參照已發表的豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因序列設計一對擴增S蛋白基因cDNA的引物，所述豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因序列的GenBank登陸號為JX560761.1，在上游引物5’端引入與紅色熒光蛋白基因3’末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入BamHI酶切位點，其中下劃線為酶切位點；在下游引物5’端引入與腸道M細胞靶向肽L-lectin-β-GF基因5’末端20bp的同源臂序列，引物序列如下：

P3:GAACTATACAAAGGATCCATTTCTTTTGTT，序列編號為SEQ ID NO.6；

P4:GTCGTCRCTRCTGACRCAAATTTATCATCATCATCTTTAT，序列編號為SEQ ID NO.7；

以豬流行性腹瀉病毒SD-M毒株提取的總RNA為模板，經MLV-反轉錄酶合成cDNA第一鏈后進行PCR擴增；PCR反應體系為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，67℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min；將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-COE，測序后獲得具有完整編碼區的豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因序列SEQID NO.2；

1.3腸道M樣細胞靶向肽L-lectin-β-GF基因的克隆

參照已發表的L-lectin-β-GF基因序列設計一對擴增L-lectin-β-GF基因的引物，所述L-lectin-β-GF基因序列的GenBank登陸號為BA000018.3，在上游引物5’端引入與豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因3’末端20bp的同源臂序列；下游引物5’端引入與pHT43多克隆位點5’末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入XmaI酶切位點，其中下劃線為酶切位點，引物序列如下：

P5:ATAAAGATGATGATGATAAATTTRCGTCARCARCGACGAC，序列編號為SEQ ID NO.8；

P6:CATTAGRCGGRCTRCCCCGGGAGTAAAATAATATGT，序列編號為SEQ ID NO.9；

以金黃色葡萄球菌菌株提取的基因組為模板，進行PCR擴增；PCR反應體系均為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃2min，30cycles，72℃10min，4℃10min；將PCR產物用T4連接酶連接到pMD19-T載體上，構建的載體分別命名為T-L，測序后獲得具有L-lectin-β-GF基因序列SEQ ID NO.3；

1.4重組表達載體pHT43-RCL的構建

以SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.2序列和SEQ ID NO.3序列為模板，用引物P1、P4進行重疊PCR擴增，PCR反應體系為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，72℃30sec，72℃4min，30cycles，72℃10min，4℃10min；將PCR產物回收，并使用One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒克隆至pHT43載體上，測序后獲得表達載體pHT43-RCL。