[發(fā)明專利]一種表達(dá)人α1?抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710011332.3
• 申請(qǐng)日: 2017-01-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058229A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 冀倩倩;郭采平;陸勇軍;丁玉江;吳櫻丹;張佩;王錦才;張戰(zhàn);黃偉榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 單香杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人α₁-抗胰蛋白酶缺乏癥(AATD)是一種世界范圍的遺傳疾病，為單基因突變導(dǎo)致的常染色體共顯性遺傳，主要表現(xiàn)為肺氣腫、肝硬化、肝癌，少數(shù)體現(xiàn)為皮膚疾病脂膜炎等。AATD患者的治療需要依賴周期性靜脈注射人α₁-抗胰蛋白酶制劑。

目前，臨床使用的人α₁-抗胰蛋白酶制劑主要由人血漿純化獲得，這限制了其大批量生產(chǎn)，導(dǎo)致了人α₁-抗胰蛋白酶制劑供不應(yīng)求，價(jià)格昂貴，僅有部分患者有條件使用。除此之外，由于診斷技術(shù)的限制，多數(shù)的AATD患者至今未得到有效診斷，所以隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步，人α₁-抗胰蛋白酶制劑的需求勢(shì)必將進(jìn)一步增加。然而，人血漿資源供應(yīng)有限，制約著血漿純化來(lái)源的人α₁-抗胰蛋白酶制劑的供應(yīng)，亟需開(kāi)發(fā)重組人α₁-抗胰蛋白酶制品。目前，世界上尚無(wú)藥用的重組人α₁-抗胰蛋白酶制品產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組體細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)獲得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、AAVS1位點(diǎn)左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列在所述AAVS1位點(diǎn)的左、右同源臂之間；在表達(dá)質(zhì)粒中篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)分別插入一個(gè)LoxP序列，且這兩個(gè)LoxP序列的方向一致，得到改造的表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)改造的表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組質(zhì)粒和靶向AAVS1位點(diǎn)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的體細(xì)胞，篩選獲得定點(diǎn)整合的體細(xì)胞；

(3)以表達(dá)Cre酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟(2)獲得的定點(diǎn)整合的體細(xì)胞，通過(guò)Cre/LoxP系統(tǒng)切除篩選標(biāo)記，篩選獲得切除了篩選標(biāo)記且穩(wěn)定表達(dá)重組α₁-抗胰蛋白酶的體細(xì)胞株。

本發(fā)明的細(xì)胞株是通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合同源重組實(shí)現(xiàn)的。其中CRISPR/Cas9的靶序列在人的基因組AAVS1位點(diǎn)，靶序列為GGGGCCACTAGGGACAGGAT。當(dāng)CRISPR/Cas9質(zhì)粒和改造后的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在靶位點(diǎn)處剪切DNA，形成雙鏈缺口。在存在含有同源臂的目的基因載體的情況下，雙鏈缺口以其為模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)，實(shí)現(xiàn)目的基因在靶點(diǎn)處的定點(diǎn)插入。

在本發(fā)明中，人基因組的AAVS1位點(diǎn)位于人19號(hào)染色體的PPP1R12C基因的內(nèi)含子中；所述人α1-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，人α1-抗胰蛋白酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、AAVS1位點(diǎn)左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒，可以通過(guò)克隆技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建，也可以直接采用商業(yè)化的產(chǎn)品質(zhì)粒。優(yōu)選地，步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、AAVS1位點(diǎn)左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒為Genome-TALER^TM貨號(hào)為DC-DON-SH01的AAVS1供體克隆載體。

優(yōu)選地，所述LoxP序列如SEQ ID NO:4所示。

AAVS1位點(diǎn)在所有的人細(xì)胞中存在，所以所有類型的人細(xì)胞都可以通過(guò)該方法進(jìn)行基因編輯，只是蛋白表達(dá)量可能有所不同。優(yōu)選地，選擇已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的人的體細(xì)胞作為受體細(xì)胞，更便于工業(yè)生產(chǎn)，最優(yōu)選地，所述人的體細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或PER.C6細(xì)胞。尤其是HEK293細(xì)胞，其表達(dá)目的蛋白的量特別好，另外，該細(xì)胞株表達(dá)的人α1-抗胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能更類似于天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利于人α1-抗胰蛋白酶制劑的推廣和應(yīng)用。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株的制備方法中，步驟(1)中的所述篩選標(biāo)記基因由熒光報(bào)告基因和抗藥性基因組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中所述篩選標(biāo)記基因中的熒光報(bào)告基因?yàn)镚FP基因，抗藥性基因?yàn)榭灌堰拭顾鼗颉?/p>