[發明專利]一種表達人α1?抗胰蛋白酶的重組細胞株及其應用

在審

• 申請號: 201710011332.3
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN107058229A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 冀倩倩;郭采平;陸勇軍;丁玉江;吳櫻丹;張佩;王錦才;張戰;黃偉榮
• 申請（專利權）人: 深圳市衛光生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 單香杰

1.一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組體細胞株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列、AAVS1位點左、右同源臂序列的表達質粒，表達質粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列在所述AAVS1位點的左、右同源臂之間；在表達質粒的篩選標記基因的兩側分別插入一個LoxP序列，且這兩個LoxP序列的方向一致，得到改造的表達人α1-抗胰蛋白酶的重組質粒；

(2)將步驟(1)改造的重組質粒和靶向AAVS1位點的CRISPR/Cas9質粒共轉染人的體細胞，篩選獲得定點整合的體細胞；

(3) 以表達Cre酶的質粒轉染步驟(2)獲得的定點整合的體細胞，通過Cre/LoxP系統切除篩選標記，篩選獲得切除了篩選標記且穩定表達重組α₁-抗胰蛋白酶的體細胞株。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述人的體細胞為HEK293細胞或PER.C6細胞。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述篩選標記為GFP基因和嘌呤霉素基因。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述LoxP序列如SEQ ID NO:4所示。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列、AAVS1位點左、右同源臂序列的表達質粒為Genome-TALER? 貨號為DC-DON-SH01的AAVS1供體克隆載體。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1) 在Genome-TALER? 貨號為DC-DON-SH01的AAVS1供體克隆載體的篩選標記基因的兩側分別插入一個LoxP序列，且這兩個LoxP序列的方向一致，得到改造的表達人α1-抗胰蛋白酶的重組質粒，LoxP序列如SEQ ID NO:4所示；

(2)將步驟(1)改造的重組質粒和靶向AAVS1位點的CRISPR/Cas9質粒共轉染人的體細胞，篩選獲得定點整合的體細胞，靶向AAVS1位點的CRISPR/Cas9質粒為GeneCopoeia公司的Genome-CRISP?質粒；

(3) 以表達Cre酶的質粒轉染步驟(2)獲得的定點整合的體細胞，通過Cre/LoxP系統切除篩選標記，篩選獲得切除了篩選標記且穩定表達重組α₁-抗胰蛋白酶的體細胞株。

7.一種權利要求1至6任一項所述構建方法制備得到的重組體細胞。

8.權利要求7所述的重組體細胞在分泌表達人α1-抗胰蛋白酶中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述分泌表達人α1-抗胰蛋白酶的方法為，培養所述重組細胞株至細胞密度為75%～95%，更換培養基，繼續培養20h～28h，收集上清液，即得。