[發(fā)明專利]一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710010974.1
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106770127A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙文超;姚學(xué)輝;楊瑞;王建立;趙福寬;王紹輝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 北京凱特來知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11260
• 代理人: 鄭立明,付久春

1.一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，包括：

步驟1，配制設(shè)定濃度的熒光指示劑工作液；

步驟2，獲取番茄葉片下表皮；

步驟3，將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮；

步驟4，用激光掃描共聚焦顯微鏡對裝載所述熒光指示劑溶液的所述番茄葉片下表皮進(jìn)行熒光圖像采集，根據(jù)所采集的熒光圖像確定番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離Ca²⁺濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述熒光指示劑采用Fluo-8AM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述配制熒光指示劑溶液包括：

步驟11，采用粉末狀的熒光指示劑為原料；

步驟12，用二甲基亞砜溶解所述熒光指示劑，配制成1或2mM的母液；

步驟13，所述母液密封分裝于-20℃避光保存；

步驟14，使用前將母液稀釋成需要濃度的工作液即為熒光指示劑工作液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述步驟14中，稀釋母液采用10mM的Mes-Tris，pH為6.1的緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述獲取番茄葉片下表皮包括：。

步驟21，選取植株健壯、苗齡為4～5片真葉的番茄幼苗；

步驟22，選取步驟1選定的所述番茄幼苗從下向上數(shù)第三片真葉相同位置的小葉；

步驟23，將步驟2選取的葉片在50μM濃度的茉莉酸甲酯中孵育一小時作為前處理；

步驟24，用尖頭鑷子撕取所述前處理后的葉片下表皮，放置在載玻片上，然后用毛筆鋪展所述表皮，用于熒光指示劑的裝載。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮包括：

步驟31，將熒光指示劑工作液的裝載濃度配制成三個濃度，分別為5μM、10μM、15μM；

步驟32，向載玻片上鋪展的所獲取的番茄葉片下表皮上分別滴加三個濃度的熒光指示劑工作液，使番茄葉片下表皮浸在熒光指示劑工作液中，然后常溫黑暗下孵育30min～50min；

步驟33，用Mes-Tris緩沖液洗滌步驟32的各番茄葉片下表皮三次，去除熒光指示劑工作液，室溫放置20min，即完成將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮上。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種番茄葉片保衛(wèi)細(xì)胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，其特征在于，所述步驟4中所用的激光掃描共聚焦顯微鏡為Leica TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡。