[發明專利]一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的方法

有效

• 申請號: 201710010182.4
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106755099B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 劉彥梅;趙佳;陳良怡
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司 11530
• 代理人: 趙永強

本發明公開了一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的斑馬魚模型，所述在體篩選促胰島β細胞功能藥物的斑馬魚模型，其基因BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為熒光蛋白序列，熒光信號均特異性地表達在胰島β細胞中，可以指示活體內胰島β細胞鈣離子信號變化。本發明創建了第一個可以指示活體內胰島β細胞功能的動物模型，本發明的轉基因斑馬魚系在其活體中可以實時觀測胰島β細胞內鈣信號的變化，直觀并準確地報告胰島β細胞功能狀態。運用該轉基因斑馬魚系，可以在活體水平進行便捷、自動化和高通量地分析胰島β細胞的功能特點，從而實現對于促進胰島β細胞功能藥物的高通量篩選，具有重要的現實意義和廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，涉及治療糖尿病藥物篩選的技術領域，尤其涉及一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的方法。

背景技術

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。其發病原因主要是機體不能分泌足夠的胰島素或者胰島素的下游靶器官組織發生了胰島素抵抗，不能有效地降低血糖，從而引起血糖升高，糖尿病發病和進一步的各種嚴重的并發癥。來自全球的研究數據顯示，2013年全世界糖尿病患病人數估計達到3.82億，我國糖尿病患病人數約達1.139億，已成為糖尿病第一大國。糖尿病已經發展成為危害人類健康、社會和經濟發展的全球性問題，大力發展糖尿病基礎研究和促進其研究成果向臨床應用轉化，已成為世界各國的迫切需要。

作為機體內唯一產生和分泌胰島素的細胞，胰島β細胞的功能和數量在糖尿病的發病過程中起著決定性的作用。目前，利用高通量篩選(High-ThroughputScreening，HTS)促進胰島β細胞數目和功能的藥物，是一種治療糖尿病非常有前景的方案。現在的研究主要集中于促進胰島β細胞增生的藥物篩選，然而，應用β細胞系或原代細胞體外篩選除了會造成與體外環境相關的假象外，也不能篩得間接促進(通過影響其它胰腺細胞或其它器官)β細胞增生的化合物。而斑馬魚因為其透明、占地小、較低廉的飼養費用成為理想的高通量篩選的動物模型。DidierY.R.Stainier研究組利用基于熒光的泛素化細胞周期指標(fucci)技術，創建了可以標記分裂期的β細胞的轉基因斑馬魚，并利用該體系進行了高內涵篩選(HighContentScreening，HCS)，得到20種可以在體促進β細胞增殖的小分子。這些分子雖然結構迥異，但主要調節三個特異的信號途徑：血清素，視黃酸和糖皮質激素。

然而，關于促胰島β細胞功能的新藥篩選方面的研究目前仍處于空白狀態，最主要的原因是缺乏一個可以在體便捷可行地甚至自動化地評價胰島β細胞功能的動物模型。

發明內容

為了克服現有技術的上述不足，本發明的目的是提供一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的斑馬魚模型，從而可以在體觀測胰島β細胞的功能。

本發明的另一個目的是提供一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的方法。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的。

一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的斑馬魚模型，斑馬魚BAC_CH211_69I14(BACPACResourcesCenter)包含基因preproinsulin(ins)的全部序列，斑馬魚BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為熒光蛋白序列，熒光信號均特異性地表達在胰島β細胞中，可以指示活體內胰島β細胞鈣離子信號變化。

優選地，所述熒光蛋白序列為紅色熒光蛋白Rcamp1.07；所述紅色熒光蛋白Rcamp1.07是一種特異性指示鈣離子濃度的紅色熒光蛋白。

優選地，利用RecE/RecT同源重組技術把BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為Rcamp1.07的序列。

一種在體篩選促胰島β細胞功能藥物的方法，包括以下步驟：

S1.獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列和構建PNPC2-ins-Rcamp1.07質粒；