[發(fā)明專利]一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201710010182.4 | 申請(qǐng)日： | 2017-01-06 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN106755099B | 公開（公告）日： | 2021-09-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 劉彥梅;趙佳;陳良怡 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 北京大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/85 | 分類號(hào)： | C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京高航知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11530 | 代理人： | 趙永強(qiáng) |
| 地址： | 100000*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 篩選 胰島 細(xì)胞 功能 藥物 方法 | ||
1.一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1.獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列和構(gòu)建包含ins啟動(dòng)子和指示鈣離子濃度的熒光蛋白編碼序列的PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒；
S2.轉(zhuǎn)基因斑馬魚的創(chuàng)建；
S3.轉(zhuǎn)基因斑馬魚的鑒定；
斑馬魚BAC_CH211_69I14包含基因ins的全部序列，斑馬魚BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為熒光蛋白序列，熒光信號(hào)均特異性地表達(dá)在胰島β細(xì)胞中，可以指示活體內(nèi)胰島β細(xì)胞鈣離子信號(hào)變化；
所述熒光蛋白序列為紅色熒光蛋白R(shí)camp1.07，所述紅色熒光蛋白R(shí)camp1.07是一種特異性指示鈣離子濃度的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法，其特征在于，利用RecE/RecT同源重組技術(shù)把BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為Rcamp1.07的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法，其特征在于，所述的獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列和構(gòu)建包含ins啟動(dòng)子和指示鈣離子濃度的熒光蛋白編碼序列的質(zhì)粒，包括以下步驟：
S1.獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列；
S2.把紅色熒光蛋白R(shí)camp1.07蛋白編碼序列克隆到R6K中間載體上；
S3.設(shè)計(jì)分別包含ins蛋白編碼序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物對(duì)，PCR擴(kuò)增Rcam1.07-frt-kana-frt序列，然后轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC_ins的大腸桿菌中，利用卡那霉素篩選Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins載體ins啟動(dòng)子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt；
S4.設(shè)計(jì)分別包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物對(duì)，擴(kuò)增兩端攜帶I-SceI酶切位點(diǎn)的PNPC2載體片段，該P(yáng)NPC2載體片段包含諾爾絲菌素抗性基因cloNAT，轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大腸桿菌中，利用諾爾絲菌素篩選出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重組質(zhì)粒的大腸桿菌克隆；
S5.轉(zhuǎn)染表達(dá)flpe的質(zhì)粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中，催化兩個(gè)frt序列的同源重組，去掉卡那霉素抗性基因，最終得到含有質(zhì)粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大腸桿菌克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法，其特征在于，所述步驟S3的引物對(duì)為：
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’；
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的方法，其特征在于，所述步驟S4的引物對(duì)為：
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’；
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。
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