[發(fā)明專利]血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710009628.1
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106872680A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 栗坤;李健;石明
• 申請（專利權(quán)）人: 秦皇島拜恩發(fā)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/68;C12N15/10
• 代理公司: 哈爾濱市邦杰專利代理事務(wù)所(普通合伙)23212
• 代理人: 吳江東

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法。

背景技術(shù)：

核酸適配體是由一段DNA或RNA組成的能與各類靶標(biāo)分子結(jié)合的化學(xué)抗體。可應(yīng)用于食品檢測、環(huán)境污染檢測和腫瘤診斷及治療等領(lǐng)域。由于適配體是體外人工快速合成的，可PCR擴增，對熱不敏感，可重復(fù)利用，克服了抗體受免疫系統(tǒng)限制，生產(chǎn)周期長，穩(wěn)定性差，儲存條件苛刻等缺陷。

已經(jīng)報道的快速篩選方法有毛細(xì)管電泳的篩選方法，這類方法庫容量小，需要多次篩選，另一類是細(xì)胞篩選的方法，篩選效率低，周期長。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種解決了從異常血清中篩選得到與正常人血清有差異蛋白的核酸適配體，簡化了篩選步驟，縮短了篩選周期，整個篩選進(jìn)程由q-PCR檢測的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法。

上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法，本篩選方法包括四步，第一步將待篩選的血清復(fù)合靶與瓊脂磁珠偶聯(lián)，形成瓊脂磁珠-血清復(fù)合物，37 ℃孵育6小時；第二步將隨機寡核苷酸文庫進(jìn)行加熱變性處理，與瓊脂磁珠-血清復(fù)合物相結(jié)合，用緩沖液沖洗掉未結(jié)合和結(jié)合力弱的靶標(biāo)分子ssDNA，獲得與血清復(fù)合物結(jié)合的核酸適配體分子；第三步對血清復(fù)合物的核酸適配體分子通過q-PCR擴增，再用PCR擴增產(chǎn)物制備得到次級ssDNA庫，通過q-PCR動態(tài)檢測與血清復(fù)合物結(jié)合的核酸適配體；第四步重復(fù)第二步所述的，篩選得到高特異性、強親和力的血清復(fù)合物核酸適配體。

所述的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法，所述的第二步隨機寡核苷酸文庫是將5nmol 隨機寡核苷酸溶于4mL結(jié)合緩沖液中，所述的結(jié)合緩沖液是磷酸緩沖液和5mol／L MgCl2組成的溶液。

所述的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法，磷酸緩沖液和5mol／L MgCl2比例為20：1。

所述的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法， 所述的第二步的靶標(biāo)分子ssDNA是與瓊脂磁珠-血清復(fù)合物結(jié)合的ssDNA。

所述的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法， 所述的第三步制備次級ssDNA庫包括如下步驟：將q-PCR擴增后的產(chǎn)物與鏈霉親和素磁珠37℃孵育6小時，用1%tween+磷酸緩沖液在80℃水浴3次，然后加入2ml結(jié)合緩沖液，變性并收集上清液，4℃保存，即制備得到次級ssDNA庫。

有益效果：

1.本發(fā)明的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選是從異常血清中篩選得到與正常人血清差異蛋白的核酸適配體，利用q-PCR動態(tài)檢測篩選進(jìn)程，操作簡單，便于快速篩選得到血清復(fù)合靶核酸適配體。

2.本發(fā)明的篩選復(fù)合靶核酸適配體簡單、快速，成本低，易于實現(xiàn)自動化。

3.本發(fā)明的篩選方法是從異常血清復(fù)合物中篩選差異蛋白核酸適配體，而毛細(xì)管電泳篩選方法是毛細(xì)管電泳只能篩選單一靶標(biāo)的核酸適配體，與細(xì)胞篩選適配體相比，篩選出的核酸適配體可以組裝成相應(yīng)疾病的篩查試劑盒，本篩選方法易于實現(xiàn)自動化。

4.本發(fā)明中如果加入充足的瓊脂磁珠，就能夠充分結(jié)合血清中的蛋白，且收集和洗脫過程簡單，易于自動化。

5.本發(fā)明的篩選方法流程簡單、快速，不需要昂貴的耗材，降低了成本。

6.本發(fā)明的篩選方法所篩選的適配體可用于獲取特異性蛋白。

7.本發(fā)明的篩選方法所篩選到的適配體可用于靶向藥物的構(gòu)建。

具體實施方式：

下面將結(jié)合本發(fā)明，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

實施例1：

一種血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法，本篩選方法包括四步，第一步將待篩選的血清復(fù)合靶與瓊脂磁珠偶聯(lián)，形成瓊脂磁珠-血清復(fù)合物，37 ℃孵育6小時；第二步將隨機寡核苷酸文庫進(jìn)行加熱變性處理，與瓊脂磁珠-血清復(fù)合物相結(jié)合，用緩沖液沖洗掉未結(jié)合和結(jié)合力弱的靶標(biāo)分子ssDNA，獲得與血清復(fù)合物結(jié)合的核酸適配體分子；第三步對血清復(fù)合物的核酸適配體分子通過q-PCR擴增，再用PCR擴增產(chǎn)物制備得到次級ssDNA庫，通過q-PCR動態(tài)檢測與血清復(fù)合物結(jié)合的核酸適配體；第四步重復(fù)第二步所述的，篩選得到高特異性、強親和力的血清復(fù)合物核酸適配體。

實施例2：

實施例1所述的血清復(fù)合靶核酸適配體篩選方法，所述的第二步隨機寡核苷酸文庫是將5nmol 隨機寡核苷酸溶于4mL結(jié)合緩沖液中，所述的結(jié)合緩沖液是磷酸緩沖液和5mol／L MgC_l2（氯化鎂）組成的溶液。

實施例3：