[發(fā)明專(zhuān)利]一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710009238.4
• 申請(qǐng)日: 2017-01-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106754947A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康慧穎;趙洪禮;海洋;張鵬;孫雪薇;魏冉;楊振;王昆;何偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 何偉
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/12;C12N15/70;G01N33/80
• 代理公司: 沈陽(yáng)杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的涉及一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

ABO血型系統(tǒng)的檢測(cè)在臨床輸血、器官移植、新生兒溶血檢測(cè)等方面有重要意義，同時(shí)在人種學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、疾病抵抗力(或易感性)等方面都有應(yīng)用價(jià)值。在輸血前，一定要檢查病人(受血者)和輸血人(供血者)的血型，并且要進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)。為了保證正確的血型鑒定，衛(wèi)生部在2000年發(fā)文(衛(wèi)醫(yī)法[2000]184號(hào))明確規(guī)定：每位供血及受血的個(gè)體均要進(jìn)行ABO血型正反定型。

人類(lèi)ABO基因位于染色體9q34.1-34.2，ABO基因包含長(zhǎng)度大小從28-688bp不等的7個(gè)外顯子和長(zhǎng)度約為19514bp的6個(gè)內(nèi)含子，其中第6和第7外顯子包括了77％的基因編碼序列，同時(shí)也包括了91％的糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)域序列。ABO基因的調(diào)控區(qū)域大約總長(zhǎng)為18-20kb，產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶，這些酶控制ABO血型抗原的生物合成。A和B等位基因編碼一個(gè)長(zhǎng)為354個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，ABO抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)是糖蛋白，其血清學(xué)特異性取決于糖鏈末端3個(gè)糖基的結(jié)構(gòu)，形成紅細(xì)胞上不同的A、B凝集原，將血型分為O、A、B及AB血型。A型血紅細(xì)胞上含A抗原，血清中含抗B抗體；B型血紅細(xì)胞上含B抗原，血清中含抗A抗體；O型血紅細(xì)胞上則沒(méi)有A及B抗原，血清中含抗A及抗B抗體；AB型血紅細(xì)胞上含A及B兩種抗原，血清中則不含抗A及抗B抗體。A抗原和抗A抗體，B抗原和抗B抗體會(huì)發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，使紅細(xì)胞發(fā)生凝聚。

目前，ABO血型試驗(yàn)檢測(cè)方法已經(jīng)成熟的試驗(yàn)方法有血凝試驗(yàn)、微柱凝集試驗(yàn)、基因檢測(cè)等方法。其中正反定型的血凝試驗(yàn)中用到的標(biāo)準(zhǔn)A型、B型和O型紅細(xì)胞與抗A、抗B抗體，存在保存期短，保存條件較苛刻(2～8℃，避光)，且容易發(fā)生微生物污染及溶血現(xiàn)象等問(wèn)題，這些問(wèn)題容易導(dǎo)致血型鑒定出差錯(cuò)，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重輸血事故。微柱凝膠法檢測(cè)時(shí)則需要特制的凝膠卡，同時(shí)需配備專(zhuān)用離心機(jī)，檢測(cè)成本較高。除以上兩種常用的方法之外，還有磁珠法。磁珠法在使用前，需進(jìn)行試劑的復(fù)溶，復(fù)溶后的試劑存放時(shí)間較短，一般7天內(nèi)必須使用完，而且需要專(zhuān)門(mén)的磁化程控振蕩器。

而急救、血型普查、陳舊血液樣本的檢測(cè)等對(duì)血型的檢測(cè)提出了更高的檢驗(yàn)要求。所以開(kāi)發(fā)更為準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的血型檢測(cè)方法，突破傳統(tǒng)的血型檢測(cè)弊端，是亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，提供一種A抗原基因重組蛋白和B抗原基因重組蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供一種A抗原基因重組蛋白和B抗原基因重組蛋白的制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白，所述的人血型A抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，方法如下：

1)提取人全血中的總DNA；

2)以DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物，利用PCR方法擴(kuò)增，分別得到A抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或B抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述的特異性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

PCR反應(yīng)體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

3)將得到的A抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和B抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pMD18-T進(jìn)行T克隆，得到重組質(zhì)粒PMD18-T/A和PMD18-T/B；

4)將重組質(zhì)粒PMD18-T/A及重組質(zhì)粒PMD18-T/B分別和表達(dá)載體pUCm-4T-1同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，分別制得重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B；