[發明專利]一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710009238.4
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106754947A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 康慧穎;趙洪禮;海洋;張鵬;孫雪薇;魏冉;楊振;王昆;何偉
• 申請（專利權）人: 何偉
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;G01N33/80
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

1.一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白，其特征在于，所述的人血型A抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

2.權利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，其特征在于，方法如下：

1)提取人全血中的總DNA；

2)以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，分別得到A抗原PCR擴增產物或B抗原PCR擴增產物；其中，所述的特異性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

3)將得到的A抗原PCR擴增產物和B抗原PCR擴增產物分別與質粒pMD18-T進行T克隆，得到重組質粒pMD18-T/A和pMD18-T/B；

4)將重組質粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分別和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，連接，分別制得重組表達載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；

5)將重組表達載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分別轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株；

6)將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，經誘導表達，純化后，得到A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。

3.根據權利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2)中，

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺ 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

4.根據權利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟6)中，所述的誘導表達是：將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，接種于LB培養基中，37℃過夜培養，次日按1:100擴大培養至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

5.根據權利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟6)中，所述的純化是：將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得純化的A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。

6.權利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白在血型檢測試劑中的應用。