[發明專利]一種生產核黃素的工程菌株及其應用

在審

• 申請號: 201710008300.8
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN108277189A
• 公開（公告）日: 2018-07-13
• 發明（設計）人: 施明安;孫向宇;G·科賽科;H·賽墨;V·梅格戴夫斯卡;M·塞瓦吉
• 申請（專利權）人: 上海創諾醫藥集團有限公司;赤峰制藥股份有限公司;赤峰蒙廣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P25/00;A23L33/15;A23K20/174;C12R1/07
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;陸鳳

本發明提供了一種生產核黃素的工程菌株及其應用。具體地，本發明提供了一種通過基因修飾(基因敲除或基因整合)獲得的工程細菌，包括對核黃素合成基因及其啟動子的改造，該菌株表現出穩定的核黃素生產能力，可以用于核黃素的生產。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種生產核黃素的工程菌株及其應用。

背景技術

核黃素(Riboflavin)，即維生素B2(VB2)，是一種水溶性的B族維生素，為黃素酶類的輔酶組成部分，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用，是人類和動物必需的一種維生素，主要應用于醫藥、食品及飼料工業作為食品、飼料添加劑和食用天然色素等。

二十世紀七十年代前，微生物發酵法生產核黃素主要以棉囊阿舒氏酵母(Ashbyagossypii)、解朊假絲酵母(Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)等真菌為主。相繼構建成功的Bacillus subtilis等產核黃素工程菌，因其具有發酵周期短、原料價廉易得、原核細胞基因工程技術成熟等優點，成為重點研究對象。此外，在芽孢桿菌屬中，包括Bacillus subtilis在內的許多菌株具有可靠的安全性，它們的發酵產物在食品與飼料工業中已有長期的應用。

目前傳統的核黃素生產菌改造方法是進行菌種誘變，比如物理誘變，化學誘變等。物理誘變、化學誘變的方法進行菌種改造，隨機性比較大，造成篩選工作量巨大，耗時長，見效慢。而且菌株基因的遺傳穩定性差，傳代過程中基因可能恢復突變，造成菌種核黃素合成能力下降。因此，本領域迫切需要構建穩定、高產的核黃素生產菌，從而進行核黃素生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種穩定、高產的核黃素生產菌及其應用。

在本發明的第一方面，提供了一種生產核黃素的工程菌株，所述菌株為芽孢桿菌(Bacillus)，并且所述菌株的基因組中整合有外源基因表達盒，所述的外源基因表達盒含有以下元件：P15啟動子和核黃素操縱子基因。

在另一優選例中，所述的外源基因表達盒包含第一外源基因表達盒和第二外源基因表達盒。

在另一優選例中，所述的第一外源基因表達盒還含有AmyE基因元件。

在另一優選例中，所述的AmyE基因包括AmyE基因片段。

在另一優選例中，所述的AmyE基因片段為AmyE基因5’端的長度為600bp的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的第一外源基因表達盒整合于所述工程菌株基因組的AmyE基因下游。

在另一優選例中，所述的第一外源基因表達盒和第二外源基因表達盒還含有抗性基因元件。

在另一優選例中，所述的第一外源基因表達盒含有的抗性基因元件與第二外源基因表達盒含有的抗性基因元件不同。

在另一優選例中，所述抗性基因選自下組：四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨芐霉素抗性基因、或其組合。

在另一優選例中，所述的外源核黃素操縱子基因選自下組：ribB基因、ribG基因、ribA基因、ribH基因、ribTD基因、或其組合。

在另一優選例中，所述的工程菌株是經原生質體融合獲得的重組子。

在另一優選例中，所述菌株的基因組中外源基因(核黃素操縱子基因)的拷貝數為10-50個，較佳地為20-40個。

在另一優選例中，所述菌株的基因組中整合有10-50個，較佳地20-40個所述的外源基因表達盒。

在另一優選例中，所述菌株的基因組中整合有30-50個拷貝的ribG基因。