[發明專利]哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定PCR擴增引物及擴增方法

有效

• 申請號: 201710007930.3
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106755452B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 石林春;唐先明;宋經元;劉金欣;劉景波;何志一;姚輝;劉建輝;劉相輝;于海龍
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所;哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海宛林專利代理事務所(普通合伙) 31361
• 代理人: 張明

本發明公開了一種用于哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的PCR擴增引物，該引物對的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本發明還提供了一種獲得哈蟆油藥材DNA條形碼的擴增方法，采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物進行PCR擴增，PCR擴增的條件為：94℃變性1分鐘；94℃變性1分鐘，50℃?54℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個循環；72℃延伸5分鐘。采用本發明的PCR擴增引物及擴增方法，其PCR擴增特異性強，能快速有效的獲得哈蟆油藥材DNA條形碼，使利用DNA條形碼技術進行哈蟆油藥材及基原動物鑒定成為可能。

技術領域

本發明涉及中藥基原物種鑒定技術領域，具體涉及一種哈蟆油藥材及其基原動物鑒定的PCR擴增引物及擴增方法。

背景技術

中藥鑒定是研究中藥品種、質量，制定中藥標準，尋找和擴大藥源的前提和基礎。中藥四大傳統鑒定方法為基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。傳統鑒定方法主要依據性狀特征差異進行鑒定，這些性狀特征是與物種的不同發育階段和環境緊密相關的表現型，易受環境飾變和知識經驗影響。而基因組DNA序列由物種的遺傳基礎決定，也是不同生物的不可變“身份證”，這為動植物分類和鑒定提供了本質依據。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術是通過PCR技術擴增基因組序列中一段通用DNA片段，對PCR擴增的通用DNA片段進行比較分析完成物種快速、準確的識別和鑒定。當前中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則已經納入2010版、2015版中國藥典，該指導原則規定動物類中藥材采用細胞色素C氧化酶亞基(COI)為主體序列，利用PCR通用引物(LCO1490和HCO2198)進行擴增反應，將擴增序列測序后進行數據庫比對，從而確定動物藥材基原物種。

但是，現在的通用引物及鑒定方法在哈蟆油藥材鑒定中的使用效果并不好，非特異擴增較多，無法進行測序。因此，本領域技術人員想要開發一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的PCR擴增引物及擴增方法。

發明內容

為了解決COI通用引物在哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定中存在非特異擴增的缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的PCR擴增引物及擴增方法。

本發明的一個方面提供了一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的擴增引物。在一個具體實施方式中，該擴增引物對的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ IDNo.2所示。

本發明的另一個方面還提供了一種獲得哈蟆油藥材DNA條形碼的擴增方法。在本發明的一個具體實施方式中，該擴增方法采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物進行PCR擴增。

進一步地，上述PCR擴增的退火溫度為50℃-54℃。

進一步地，上述PCR擴增的條件為：94℃變性1分鐘；94℃變性1分鐘，50℃-54℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個循環；72℃延伸5分鐘。

優選地，上述PCR擴增的退火溫度為54℃。

本發明的優勢在于，使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的擴增引物，并結合50℃-54℃退火的PCR反應條件，尤其是54℃的退火溫度，能夠對樣品DNA進行特異性的擴增，從DNA電泳結果可以得到單一擴增條帶。基于上述引物及擴增方法，能快速有效的獲得哈蟆油藥材DNA條形碼，使利用DNA條形碼技術進行哈蟆油藥材基原動物鑒定成為可能。

附圖說明