[發(fā)明專(zhuān)利]哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710007930.3
• 申請(qǐng)日: 2017-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106755452B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石林春;唐先明;宋經(jīng)元;劉金欣;劉景波;何志一;姚輝;劉建輝;劉相輝;于海龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所;哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海宛林專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 31361
• 代理人: 張明

1.一種獲得哈蟆油藥材DNA條形碼的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增方法采用如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物中，簡(jiǎn)并堿基R代表是A或G；Y代表是C或T；所述PCR擴(kuò)增的條件為：94℃變性1分鐘；94℃變性1分鐘，54℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘；

其中，PCR擴(kuò)增的模板DNA的獲取方式如下：

取哈蟆油藥材5mg，置入2.0mL離心管，加入500μL含0.1％～2％鹽酸的水，使用研磨杵反復(fù)研磨；

加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸鈉、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸鈉的緩沖液和40μL的20mg/mL蛋白酶K裂解樣品，使用渦旋混合儀混勻30秒，56℃孵育至溶液澄清，每半小時(shí)顛倒混合樣品2～3次，或者使用水浴振蕩器；

加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸的緩沖液，渦旋混勻30秒；

加入700μL比例為25:24:1的酚/氯仿/異戊醇，在渦旋混合器上振蕩混勻30秒，室溫下離心5分鐘；

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入700μL比例為24:1的氯仿/異戊醇，在渦旋混合器上振蕩混勻30秒，室溫下離心5分鐘；

加入等體積無(wú)水乙醇，在渦旋混合器上振蕩混勻30秒，室溫下靜置2～5分鐘；

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入1/10體積的3mol/L PH 5.2的乙酸鈉，在渦旋混合器上振蕩或用手指輕彈離心管壁使之混勻；

加入2～2.5倍體積冰冷的無(wú)水乙醇或等體積異丙醇，在渦旋混合器上振蕩混勻，冰浴5分鐘，室溫下離心5分鐘；

棄去上清，加入1mL預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀1～2次；

沉淀在真空干燥器或者真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，或者小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，常溫自然干燥；

加入50μL ddH₂O溶解，獲得模版DNA。