[發明專利]核酸制備及分析

在審

• 申請號: 201710006242.5
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106755451A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 胡光輝;丁崴;何新軍;孫德斌;黃雋
• 申請（專利權）人: 蘇州艾達康醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙)32251
• 代理人: 夏振

1.一種用于指數擴增雙鏈靶核酸的方法，其特征在于所述方法包括：

(a)使接頭連接到單個雙鏈靶核酸分子上使雙鏈靶核酸分子末端相連，其中所述接頭包括(i)配對區域和(ii)非配對區域；

(b)提供(i)目標特異性引物，其與靶核酸的結合位點互補；和/或，(ii)接頭引物，其與非配對區域互補鏈上的引物結合位點互補；

(c)在目標特異性引物和/或接頭引物存在的條件下進行擴增反應擴增末端相連的雙鏈靶核酸分子，產生第一個擴增分子。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中非配對區域是一個環結構，其5’和/或3’突出，或形成泡泡形(bubble)結構；優選的，非配對區域是一個環結構；優選的，所述環結構含有尿嘧啶，且所述方法還包括和在擴增步驟前由尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)切除環結構的方法。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中目標特異性引物在5'端具有一個標簽序列。

4.根據權利要求1-3中的任一項所述的方法，其特征在于，所述擴增反應體系中包括第一阻斷物，所述第一阻斷物具有第一序列，(i)該序列與靶核酸的野生型等位基因相匹配或互補，且(ii)該序列能夠通過DNA聚合酶延伸；優選的，擴增反應體系還包括第二阻斷物，此阻斷物含有第二序列，該序列與野生型等位基因的互補序列相匹配或互補；

優選的，第一阻斷物或第二阻斷物包括一個或多個修飾的核酸或鍵；

優選的，第一阻斷物或第二阻斷物3’端有一個修飾的核酸或鍵；

優選的，所述的修飾核苷酸或鍵包括PNA，LNA，2’-O-甲基核苷酸，2’-O-烷基核酸，2’-O-氟核酸、硫代磷酸酯鍵，以及它們的任意組合；

優選的，第一阻斷物或第二阻斷物不與接頭引物或目標特異性引物重疊。

5.根據權利要求1-4所述的方法，其特征在于，靶核酸是ctDNA；優選的，靶核酸長度在20bp-20kb之間；優選的，靶核酸長度在20bp-2kb之間；優選的，靶核酸長度在20bp-1kb之間；優選的，靶核酸長度在20bp-200bp之間；優選的，靶核酸包括編碼EGFR T790M，EGFR L858R，BRAF V600E，BRAF V600K，BRAF V600D，BRAF V600G，BRAF V600A，或BRAF V600R或KRAS G12V的區域。

6.一種獲得一個或多個雙鏈靶核酸序列的方法，包括：

根據權利要求書1的方法得到的第一個擴增分子；

在第二擴增反應中擴增第一擴增分子，包括一對引物，每條引物有一個條形碼(barcode)序列，以產生第二次擴增的分子，和測序第二次擴增的分子。

7.用于評估患癌個體的方法，包括：

(1)從該個體中獲得生物樣品；

(2)和根據權利要求1中的方法進行檢測以確定在生物樣品中是否有一個或多個靶核酸。

8.根據權利要求7的方法，其特征在于，所述生物樣品是血清，血漿，全血，唾液，或痰；優選的，所述方法還包括確定靶核酸存在的情況下，決定或者建議的治療方案；所述方法還包括在所述一個或多個靶核酸存在時施用所述治療的步驟；所述方法中，擴增反應是一個多重擴增反應。

9.用于擴增靶核酸的試劑盒，包括：

(a)接頭，所述接頭包括配對區域和非配對區域；

(b)和非配對區域互補鏈上的引物結合位點互補的接頭引物，以及，

(c)和靶核酸上的結合位點互補的靶向特異性引物。

10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括:

(d)第一阻斷物包括第一序列，此序列(i)和靶核酸的野生型等位基因相匹配或者互補，并且(ii)能夠通過DNA聚合酶進行延伸，或，

(e)第二阻斷物包括第二序列，此序列和野生型等位基因的互補相匹配或互補。

優選的，非配對區域是一個環結構，5’和/或3’突出，或泡泡形(bubble)；優選的，非配對區域是一個環結構；優選的，環結構含有尿嘧啶；優選的，至少一條引物和阻斷物包含一個或多個修飾的核酸或修飾的鍵；優選的，修飾的核苷酸或鍵包括PNA，LNA，2’-O-甲基核苷酸，2‘-O-烷基核酸，2’-氟核酸、硫代磷酸酯鍵，以及它們的任意組合；優選的，還包括一條或多條Illumina P5barcode引物，Illumina P7barcode引物，Ion Torrent A barcode引物和Ion Torrent P1barcode引物。