[發(fā)明專(zhuān)利]核酸制備及分析

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710006242.5
• 申請(qǐng)日: 2017-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106755451A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡光輝;丁崴;何新軍;孫德斌;黃雋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州艾達(dá)康醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)32251
• 代理人: 夏振

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于制備和分析核酸的方法和體系(systems)。

背景技術(shù)

基于核酸的檢測(cè)能檢測(cè)到樣品中特定核酸(DNA或RNA)的存在。它已被用于各種臨床和診斷。對(duì)于傳染性疾病，基于核酸的診斷能夠從感染的生物體內(nèi)檢測(cè)到DNA或RNA。對(duì)于非傳染性疾病，基于核酸的診斷可用于檢測(cè)特定基因或與疾病相關(guān)基因的表達(dá)。臨床和診斷的一個(gè)主要關(guān)注是檢測(cè)具有重要臨床意義的低水平突變和少量等位基因的能力。能夠辨別突變?cè)诤芏喾矫娣浅Ｖ匾绕涫菍?duì)從組織樣本中和體液如血漿或血清進(jìn)行癌癥早期檢測(cè)；評(píng)估手術(shù)或化療后的疾病殘留；疾病分期和預(yù)后的分子圖譜或個(gè)性化治療；監(jiān)測(cè)治療結(jié)果和癌癥緩解/復(fù)發(fā)。高效檢測(cè)癌癥相關(guān)的體細(xì)胞突變很大程度上取決于所用的技術(shù)和方法。

大規(guī)模平行DNA測(cè)序引領(lǐng)了劃時(shí)代的核酸檢測(cè)方法，僅用傳統(tǒng)的Sanger方法一小部分時(shí)間和成本識(shí)別成百上千億的堿基對(duì)。不像傳統(tǒng)技術(shù)簡(jiǎn)單報(bào)告平均基因型，這些技術(shù)能統(tǒng)計(jì)很多單獨(dú)的DNA片段，檢測(cè)出混合物中輕微的突變。然而，這種深度測(cè)序的方法有局限性。雖然在理論上，當(dāng)深度測(cè)序足夠數(shù)量的分子時(shí)，任何大小的DNA亞群都是可以檢測(cè)的，在樣本制備和測(cè)序過(guò)程中導(dǎo)致的誤差使得實(shí)際的檢測(cè)受限。混合物的PCR擴(kuò)增也由于隨機(jī)的和非隨機(jī)的擴(kuò)增偏向性導(dǎo)致群體偏差(population skewing)，進(jìn)而導(dǎo)致特定變異的代表性不足或者過(guò)多(Kanagawa T.Bias and Artifacts in Multitemplate Polymerase Chain Reactions(PCR).J Biosci Bioeng.2003；96:317-23.)。

因此，有必要提供富集少數(shù)群體等位基因和基因突變的系統(tǒng)和方法。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)旨在提供一種富集少量等位基因和突變的體系和方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種指數(shù)擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)雙鏈靶核酸的方法。該方法包括:(a)雙鏈靶核酸和接頭末端相連得到雙鏈核酸，其中接頭包括(i)配對(duì)區(qū)域和(ii)非配對(duì)區(qū)域；(b)提供(i)接頭引物，此引物可互補(bǔ)或雜交到非配對(duì)區(qū)域的引物結(jié)合位點(diǎn)和(ii)目標(biāo)特異性引物，此引物可互補(bǔ)或雜交到靶核酸的結(jié)合位點(diǎn)；(c)擴(kuò)增末端相連的雙鏈核酸，擴(kuò)增反應(yīng)體系包括接頭引物和目標(biāo)特異性引物。

非配對(duì)區(qū)域可以是環(huán)(ring)結(jié)構(gòu)，5’和/或3’突出(overhang)，或形成泡泡形(bubble)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，非配對(duì)區(qū)域是一個(gè)環(huán)。在這種情況下，這個(gè)環(huán)含有尿嘧啶，且需在擴(kuò)增前由尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)切割環(huán)。特異性引物、接頭引物或兩者都可以在5’端包含一個(gè)標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列可用于檢測(cè)，測(cè)序，克隆和/或擴(kuò)增。

在其他實(shí)施例中，擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括第一阻斷物，(i)此阻斷物與靶核酸中的野生型等位基因相匹配或互補(bǔ)，(ii)能夠通過(guò)DNA聚合酶延伸。擴(kuò)增反應(yīng)體系可以進(jìn)一步包括具有與野生型等位基因相匹配或互補(bǔ)的第二阻斷物。第一或第二阻斷物包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核酸或鍵。例如，第一阻斷物或第二阻斷物可以在3’端有一個(gè)修飾的核酸或鍵。修飾的核苷酸或鍵包括PNA，LNA，2’-O-甲基核酸，2’-O-烷基核酸，2’-氟核酸，硫代磷酸酯鍵以及它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，第一或第二阻斷物不與接頭引物或目標(biāo)特異性引物重疊。

在上述方法中，靶核酸可以是細(xì)胞游離核酸(cfNA)，細(xì)胞游離DNA(cfDNA)或循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。靶核酸長(zhǎng)度在20bp到20kb之間，如20bp到2kb，20bp到1kb，或20bp到200bp。在一些例子中，靶核酸覆蓋編碼EGFR T790M，EGFR L858R，BRAF V600E，BRAF V600K BRAF V600D，BRAF V600G，BRAF V600A，或BRAF V600R的區(qū)域。

上述方法可用于獲得一個(gè)或多個(gè)雙鏈靶核酸的序列。該方法包括根據(jù)上述方法獲得的第一批擴(kuò)增分子，對(duì)第一批擴(kuò)增分子進(jìn)行第二次擴(kuò)增反應(yīng)獲得第二批擴(kuò)增產(chǎn)物并測(cè)序所獲得的產(chǎn)物，此擴(kuò)增反應(yīng)包括一對(duì)帶有條形碼(barcode)的引物。