[發明專利]一種基于共線性基因開發標記鑒定大白菜-結球甘藍易位系的方法

有效

• 申請號: 201710004003.6
• 申請日: 2017-01-04
• 公開（公告）號: CN106701952B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 軒淑欣;蘇建輝;申書興;趙建軍;王彥華;馬聰
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供了一種基于共線性基因開發標記鑒定大白菜?結球甘藍易位系的方法，包括：a)確定易位系中結球甘藍的基因片段區段；獲得所述結球甘藍的基因片段區段及其側翼區域所有基因序列以及大白菜中對應的共線性基因序列，并根據基因序列的差異位點設計覆蓋差異位點區域的引物；b)利用上述引物對易位系親本大白菜和親本結球甘藍進行PCR擴增，根據擴增結果確定結球甘藍相對于大白菜特異的基因標記；c)利用上述基因標記對易位系親本大白菜、親本結球甘藍和易位系自交后代進行PCR擴增，根據擴增結果獲得易位系的鑒定結果。本發明基于大白菜和結球甘藍共線性基因序列差異位點設計引物，增加擴增效率的差異，可以直接鑒定外源基因的導入。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種基于共線性基因開發標記鑒定大白菜-結球甘藍易位系的方法。

背景技術

易位系是某物種(供體)的一段染色體和另一物種(受體)的相應染色體片段發生交換后形成的新類型，是作物改良育種的一種手段，可提高作物抗性，增加作物產量和提升作物品質，在作物育種方面具十分重要的意義。在目的基因導入易位系的過程中，對被轉移的基因及其染色體片段在受體背景中進行追蹤和鑒定，可以提高選擇的準確性，縮短育種周期，提高育種效率。因此，對導入易位系中的外源染色體片段進行準確鑒定十分重要。

分子標記(Molecular markers)，是以個體間遺傳物質內核苷酸序列(DNA)變異為基礎的遺傳標記，在基因型確定、遺傳多樣性分析、外源片段鑒定、標記輔助育種和系統發育分析等研究中是非常有價值的工具。目前用于鑒定易位系外源片段的方法主要是SSR標記(Simple sequence repeat marker)和InDel標記(Insert/delete marker)。但是由于SSR標記在大白菜和甘藍間的多態性比率較低，無法用于鑒定大白菜遺傳背景中外源甘藍片段的導入，盡管InDel標記在大白菜-結球甘藍易位系鑒定中表現了很大優勢，但InDel標記無法鑒定具體導入的外源基因和片段在大白菜染色體的的精確位置，以及感興趣基因是否能夠穩定遺傳，這為易位系中外源基因的表達和互作研究帶來了困難。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于共線性基因開發標記鑒定大白菜-結球甘藍易位系的方法，本發明提供的方法能夠鑒定大白菜-結球甘藍易位系中具體導入的外源基因和片段的精確位置，以及感興趣基因是否能夠穩定遺傳。

本發明的目的是基于白菜和甘藍共線性基因差異序列開發相對特異的基因標記，為大白菜和結球甘藍物種鑒別及大白菜-結球甘藍易位系的精確鑒定提供新方法，為外源甘藍基因在大白菜遺傳背景下的表達、功能研究及利用甘藍基因改良大白菜遺傳背景奠定基礎。

本發明的基本原理是：大白菜與結球甘藍同屬十字花科蕓薹屬，且都已經完成測序，基于序列的blast發現二者基因組間有較高的同源性，存在很多染色體共線性區段。本發明針對大白菜、結球甘藍共線性基因序列差異位點設計引物，以大白菜、結球甘藍及其易位系基因組DNA為模板進行PCR擴增，差異位點的不同導致引物的結合效率差異，從而影響PCR擴增效率，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測在供試材料間會表現出PCR產物的有無、帶的強弱或位置的差異，若某基因標記在易位系中擴增結果只與大白菜一致，表明該異附加系中沒有導入該基因，若某基因標記在易位系中擴增產物只與結球甘藍一致或同時與大白菜和結球甘藍相同，表明該易位系中導入了該基因。

本發明的特點是：基于大白菜和結球甘藍共線性基因序列差異位點設計引物，增加擴增效率的差異，提高引物多態性，用于大白菜和結球甘藍物種的鑒別；標記引物在基因內部設計，可以直接鑒定外源基因的導入；共線性基因在大白菜和結球甘藍中比例較高，可以開發密度高基因標記，更準確鑒定外源染色體片段的大小。

本發明提供了一種基于共線性基因開發特異標記鑒定大白菜-結球甘藍易位系的方法，包括：

a)確定大白菜-結球甘藍易位系中結球甘藍的基因片段區段；