[發(fā)明專利]基于duplex-seq的超低頻突變位點(diǎn)檢測(cè)分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710001346.7
• 申請(qǐng)日: 2017-01-03
• 公開（公告）號(hào): CN106599616B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉港飚;朱月艷;孫子奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海派森諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): G16B20/20
• 分類號(hào): G16B20/20
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

本發(fā)明公開的一種基于duplex?seq的超低頻突變位點(diǎn)檢測(cè)分析方法，包括如下步驟：1)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，降低數(shù)據(jù)噪聲，為后續(xù)分析提供有效數(shù)據(jù)；2)把隨機(jī)barcode提取到序列文件的每一條序列的標(biāo)題行，方便后續(xù)對(duì)barcode進(jìn)行快速檢索并創(chuàng)建一致性序列；3)根據(jù)family barcode和duplex barcode創(chuàng)建一致性序列，排除由于建庫(kù)過程或者PCR過程中引入的突變；4)根據(jù)duplex?tag構(gòu)建雙鏈一致性序列，進(jìn)一步排除序列中的非對(duì)稱突變位點(diǎn)；5)對(duì)比對(duì)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行局部質(zhì)量矯正，并進(jìn)行低頻變異位點(diǎn)檢測(cè)；將變異位點(diǎn)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、功能、及臨床表型三個(gè)層次的注釋；6)統(tǒng)計(jì)SSCS、DCS序列數(shù)目、比對(duì)結(jié)果、變異位點(diǎn)信息，并輸出可視化圖表。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物信息數(shù)據(jù)處理方法，特別涉及一種基于duplex-seq的超低頻突變位點(diǎn)檢測(cè)分析方法，其主要應(yīng)用與第二代高通量測(cè)序領(lǐng)域，基于duplex-seq全外顯子組測(cè)序，對(duì)ctDNA的超低頻變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析。

背景技術(shù)

下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展如火如荼，其正在以勢(shì)如破竹的力量深刻變革著傳統(tǒng)遺傳學(xué)的研究，并因此催生了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的萌芽。相比與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該技術(shù)可以一次性檢測(cè)成千上萬的遺傳突變。然而美中不足的是下一代測(cè)序技術(shù)仍然存在相對(duì)較高的錯(cuò)誤率(0.1～1％)。對(duì)于高頻的遺傳突變檢測(cè)，這個(gè)錯(cuò)誤是可以接受的，但是對(duì)于一些低頻突變的檢測(cè)，該測(cè)序方法存在很大的局限性。

低頻突變的檢測(cè)現(xiàn)在應(yīng)用越來越廣泛，特別是在腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)中的應(yīng)用倍受關(guān)注。腫瘤組織中出現(xiàn)突變的細(xì)胞比例小于1％，對(duì)于這樣的低頻突變，一般的方法很難檢測(cè)到。因此有學(xué)者提出了雙重標(biāo)記的測(cè)序方法(Duplex Sequencing，Duplex-seq)(KennedySR,Schmitt MW,Fox EJ,Kohrn BF,Salk JJ,Ahn EH,et al.Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.Nature protocols.2014；9:2586-606.)和(Newman AM,Bratman SV,To J,Wynne JF,Eclov NC,Modlin LA,et al.Anultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broadpatient coverage.Nature medicine.2014；20:548-54.)。該方法能應(yīng)用于任何雙鏈DNA樣本，通過對(duì)雙鏈加入隨機(jī)的雙重標(biāo)簽序列，使得每條鏈都具有唯一的分子標(biāo)記序列(UniqueMolecular index，UMI)，可來排除由于建庫(kù)過程或者測(cè)序過程中引入的誤差。對(duì)于此類測(cè)序數(shù)據(jù)的分析方法已有相關(guān)報(bào)道(Newman AM,Lovejoy AF,Klass DM,Kurtz DM,ChabonJJ,Scherer F,et al.Integrated digital error suppression for improveddetection of circulating tumor DNA.Nature biotechnology.2016；34:547-55)，但是都存在一定的不足，因此，本發(fā)明擬通過開發(fā)新的方法來對(duì)Duplex-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行更加系統(tǒng)專業(yè)的分析，以用來指導(dǎo)相關(guān)疾病患者在臨床中選擇更好的藥物和劑量，達(dá)到精準(zhǔn)、高效治療的目的，以及對(duì)健康人群的患病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估提供更為準(zhǔn)確的參考。

Duplex-seq技術(shù)在高通量測(cè)序已得到廣泛應(yīng)用，基于Duplex-seq對(duì)低頻突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的分析方法也越來越多，但是目前存在以下幾點(diǎn)問題：

1.數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：現(xiàn)有Duplex-seq的數(shù)據(jù)分析方法流程中，未見對(duì)前期數(shù)據(jù)質(zhì)量的系統(tǒng)分析，如數(shù)據(jù)重復(fù)率、UMI的種類、數(shù)量、比例、R1R2的平衡性等。

2.UMI的差異分析：現(xiàn)有Duplex-seq數(shù)據(jù)分析方法中對(duì)于單鏈特異性UMI和雙鏈互補(bǔ)的UMI的綜合和獨(dú)立分析還未見報(bào)道。