[發(fā)明專利]基于duplex-seq的超低頻突變位點(diǎn)檢測(cè)分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710001346.7
• 申請(qǐng)日: 2017-01-03
• 公開（公告）號(hào): CN106599616B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉港飚;朱月艷;孫子奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海派森諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): G16B20/20
• 分類號(hào): G16B20/20
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

1.一種基于duplex-seq的超低頻突變位點(diǎn)檢測(cè)分析方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，降低數(shù)據(jù)噪聲，為后續(xù)分析提供有效數(shù)據(jù)；

2)把隨機(jī)barcode提取到序列文件的每一條序列的標(biāo)題行，方便后續(xù)對(duì)barcode進(jìn)行快速檢索并創(chuàng)建一致性序列；

3)根據(jù)family barcode和duplex barcode創(chuàng)建一致性序列，排除由于建庫(kù)過程或者PCR過程中引入的突變；

4)根據(jù)duplex-tag構(gòu)建雙鏈一致性序列，進(jìn)一步排除序列中的非對(duì)稱突變位點(diǎn)；

5)對(duì)經(jīng)過上述步驟處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行局部質(zhì)量矯正，并進(jìn)行低頻變異位點(diǎn)檢測(cè)；將變異位點(diǎn)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、功能、及臨床表型三個(gè)層次的注釋；

6)統(tǒng)計(jì)SSCS、DCS序列數(shù)目、比對(duì)結(jié)果、變異位點(diǎn)信息，并輸出可視化圖表；

所述步驟3)包括如下步驟：

3.1)把步驟(2)中獲得的序列，比對(duì)到相應(yīng)的基因組獲得比對(duì)文件；

3.2)獲取比對(duì)文件中基因組的第一個(gè)位點(diǎn)；

3.3)對(duì)所有比對(duì)到步驟3.2)提取的位點(diǎn)上的reads進(jìn)行flag字段的過濾，對(duì)于未比對(duì)上的reads則另存為NM文件；其中flag字段為77和141；

3.4)對(duì)所有通過步驟3.3)過濾后的reads根據(jù)duplex-tag進(jìn)行排序，并進(jìn)行分組；

3.5)提取步驟3.4)分組中的第一組duplex-tag及其相關(guān)序列；

3.6)對(duì)步驟3.5)中提取的一組序列根據(jù)CIGAR string進(jìn)一步分組歸類，對(duì)于含有相同CIGAR string的序列則進(jìn)行下一步分析，對(duì)于不含有共同CIGAR string的序列則另存為L(zhǎng)CC文件；

3.7)對(duì)步驟3.6)中分組的序列，計(jì)算其family size，如果family size小于3則丟棄該組序列，通過則進(jìn)行下一步的分析；

3.8)對(duì)步驟3.7)中通過的一組序列創(chuàng)建單鏈一致性序列；對(duì)于堿基一致性較高的位點(diǎn)則該位點(diǎn)歸一為含量較高的堿基，對(duì)于一致性不夠好的序列則該位點(diǎn)以N代替；一致性的值根據(jù)用戶自行定義，設(shè)置為70％；

3.9)通過3.8)構(gòu)建的單鏈一致性序列，過濾掉含有30％以上N的序列，并輸出最終合格的序列到單鏈一致性(SSCS)文件；

3.10)創(chuàng)建完SSCS后，如果含有更多的duplex-tag，則重復(fù)上述步驟3.6)-3.9)，如果沒有則進(jìn)入3.11)步驟；

3.11)若果還有更多的位點(diǎn)，則重復(fù)上述步驟3.3)-3.10)，否則結(jié)束該步驟；

所述步驟4)包括如下步驟：

4.1)將上述步驟3)中獲得的單鏈一致性序列文件轉(zhuǎn)化為sam格式文件，并去除familybarcode序列，方便下面創(chuàng)建雙鏈一致性序列；

4.2)提取比對(duì)文件中的第一個(gè)基因組位點(diǎn)信息；

4.3)提取步驟4.2)中基因組位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一個(gè)duplex-tag；

4.4)尋找與步驟4.3)中的duplex-tag進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)的duplex-tag，如果沒有對(duì)應(yīng)的duplex-tag與其進(jìn)行匹配則該序列丟棄，如果有匹配的tag則進(jìn)入步驟4.5)；

4.5)對(duì)含有相同duplex-tag的序列構(gòu)建雙鏈一致性序列；

4.6)對(duì)步驟4.5)創(chuàng)建的雙鏈一致性序列進(jìn)行過濾，如果序列中含有大量的N則該序列丟棄，否則進(jìn)入步驟4.7)；

4.7)輸出為雙鏈一致性文件(DCS),并輸出對(duì)應(yīng)的配對(duì)序列R1、R2；

4.8在步驟4.5)創(chuàng)建完雙鏈一致性序列后，如果還有更多的duplex-tag則重復(fù)步驟4.4)-4.7)，如果沒有duplex-tag則進(jìn)入步驟4.9)；

4.9)如果還有更多的位點(diǎn)需要分析，則重復(fù)步驟4.3)-4.8)；否則結(jié)束分析。