[發明專利]全基因組數字擴增的方法

在審

• 申請號: 201680090529.4
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN109923214A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: X·S·謝;邢棟;張棋涵
• 申請（專利權）人: 哈佛學院董事及會員團體
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;錢文宇

本公開提供了一種用于基因組DNA擴增的方法，如全基因組擴增，包括使用轉座酶系統制造包含引物結合位點的基因組DNA的片段，在油中分離在其自身水性微滴內的各片段以及PCR擴增試劑，擴增在其自身水性微滴內的各片段，使微滴反乳化以獲得擴增子，并對擴增子進行測序。

政府權益的聲明

本發明是在國立衛生研究院(National Institutes of Health)的5DP1CA186693下于政府資助下完成。政府對本發明享有某些權利。

背景技術

發明領域

本發明的實施方式通常涉及用于擴增痕量DNA(如來自單個細胞的DNA)的方法和組合物，從而檢測其基因序列，特別是整個基因組。

背景技術

在細胞間變異和種群異質性起關鍵作用的研究中，如腫瘤生長、干細胞重編程、胚胎發育等，進行單個細胞基因組測序的能力非常重要。當進行測序的細胞樣品非常珍貴或稀有或以微量存在時，單個細胞基因組測序也同樣非常重要。準確的單個細胞基因組測序的重要之處在于基因組DNA(可以是處于微量的)的初始擴增。

多重置換擴增(MDA)是在測序和其它分析之前用于單個細胞基因組DNA領域的常用方法。在該方法中，隨機引物退火后，利用具有強鏈置換活性的DNA聚合酶進行延伸。來自單個細胞的原始基因組DNA以級聯樣的形式指數地擴增，以形成超支化DNA結構。擴增來自單個細胞的基因組DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),單個人細胞的單核苷酸和拷貝數變異的基因組范圍檢測(Genome-wide detection ofsingle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell),Science338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于環型的擴增循環(MALBAC)。本領域所知的另一方法是簡并寡核苷酸引發的PCR或DOP-PCR。用于單個細胞基因組DNA的若干其他方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用簡并寡核苷酸的全基因組擴增允許成百上千個基因型以少于一納克的基因組DNA進行(Whole genome amplification using a degenerateoligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on lessthan one nanogram of genomic DNA),Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1996.93(25):14676-9頁；Telenius,H.,等,簡并寡核苷酸引發的PCR：通過單個簡并引物的常規擴增(Degenerateoligonucleotide-primed PCR:general amplification of target DNA by a singledegenerate primer),Genomics,1992.13(3):718-25頁；Zhang,L.,等,單個細胞的全基因組擴增：對基因分析的啟示(Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1992,89(13):5847-51頁；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用單個引物的PCR的全基因組擴增(Whole genome amplification usingsingle-primer PCR),Biotechnology Journal,2008,3(3):378-82頁；Dean,F.B.,等,使用多重置換擴增的完整人基因組擴增(Comprehensive human genome amplification usingmultiple displacement amplification),Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2002.99(8):5261-6頁；Lage,J.M.,等,使用超支化鏈置換擴增和列陣-CGH對小DNA樣品中基因變異的全基因組分析(Whole genomeanalysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranchedstrand displacement amplification and array-CGH),Genome Research,2003,13(2):294-307頁；Spits,C.,等,單個細胞全基因組置換擴增的優化和評價(Optimization andevaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification),Human Mutation,2006,27(5):496-503頁；Gole,J.,等,使用納升微管進行單個細胞大規模平行聚合酶克隆和基因組測序(Massively parallel polymerase cloning and genomesequencing of single cells using nanoliter microwells),Nature Biotechnology,2013.31(12):1126-32頁；Jiang,Z.,等,使用多重置換擴增的單個精子的基因組擴增(Genome amplification of single sperm using multiple displacementamplification),Nucleic Acids Research,2005,33(10):e91頁；Wang,J.,等,人精子細胞中重組活性和新生突變比例的基因組范圍單個細胞分析(Genome-wide Single-CellAnalysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in HumanSperm),Cell,2012.150(2):402-12頁；Ni,X.,肺癌患者單循環腫瘤細胞中可再生拷貝數變異模式(Reproducible copy number variation patterns among single circulatingtumor cells of lung cancer patients),PNAS,2013,110,21082-21088；Navin,N.,通過單個細胞測序推測腫瘤進化(Tumor evolution inferred by single cell sequencing),Nature,2011,472(7341):90-94；Evrony,G.D.,等,人大腦中11個反轉錄轉座和體細胞突變的單個神經元測序分析(Single-neuron sequencing analysis ofl1retrotransposition and somatic mutation in the human brain),Cell,2012.151(3):483-96頁；和McLean,J.S.,等,使用高通量單個細胞基因組學平臺從醫院槽中的生物膜中回收牙齦卟啉單胞菌病原體的基因組(Genome of the pathogen Porphyromonasgingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform),Genome Research,2013.23(5):867-77頁。關于全基因組擴增方面的方法報道于WO 2012/166425、US 7,718,403、US 2003/0108870和US 7,402,386。