[發明專利]具有轉谷氨酰胺酶識別位點的FKBP結構域

有效

• 申請號: 201680081877.5
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN108699104B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: M.施雷姆爾;W.斯蒂芬
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C07K1/13
• 分類號: C07K1/13;C12N9/90;G01N33/532;G01N33/58;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;黃希貴

本發明涉及重組轉谷氨酰胺酶（TG）底物，其包含FKBP多肽的FKBP結構域的氨基酸序列，其中其“插入翼片”（IF）結構域至少部分地被替換為5至20個氨基酸的氨基酸序列（“Q標簽”），其包含與肽序列X₁?YRYRQ?X₂（SEQ ID NO.1）的YRYRQ部分具有至少80%序列同一性的序列，并且其中所述TG底物是關于白色庫茨涅爾氏菌TG的TG功能的底物。本發明另外涉及所述底物的用途。

本發明涉及重組轉谷氨酰胺酶（TG）底物，其包含FKBP多肽的FKBP結構域的氨基酸序列，其中其“插入翼片（insert-in-flap）”（IF）結構域至少部分地被替換為 5至20個氨基酸的氨基酸序列（“Q標簽”），其包含與肽序列X₁-YRYRQ-X₂（SEQ ID NO. 1），特別是肽序列的YRYRQ部分具有至少80%序列同一性的序列，并且其中所述TG底物是白色庫茨涅爾氏菌（Kutzneria albida） TG（KalbTG）的TG功能的底物。本發明另外涉及所述底物的用途。

發明背景

可溶性和/或免疫反應性抗原及其變體對于體外診斷測試是重要的。例如，使用病毒外殼蛋白gp41的重組和可溶性變體，由此檢測HIV-1感染。

免疫反應性抗原及其變體所需的溶解度在有效測定的設計中可能是挑戰，但可以通過融合至具有肽基脯氨酰異構酶（PPIase）活性的一個或多個蛋白伴侶單元來改善。使用蛋白質支架用于工程改造由支架展示的多肽結構域的技術是抗體和抗體片段領域已知的。因此，結構域例如抗體的抗原結合區的可變環已被廣泛改造，以產生對已知靶具有改善結合（例如親和力和/或特異性）的氨基酸序列區段（參見WO2014/071978）。

FK506結合蛋白（FKBP）已在從酵母到人的許多真核生物中發現，并且充當用于含有脯氨酸殘基的蛋白質的蛋白質折疊蛋白伴侶。連同親環蛋白一起，FKBP屬于親免蛋白家族。在人基因組中，編碼了15種蛋白質，其區段與12 kDa蛋白質的序列具有顯著同源性，所述12 kDa蛋白質是強效免疫抑制性大環內酯類FK506或雷帕霉素的靶。FK506結合蛋白（FKBP）的12 kDa原型，稱為FKBP-12，是豐富的細胞內蛋白質。FKBP12充當PPIase，其催化脯氨酰順/反式構象之間的相互轉換。FKBP涉及多種細胞功能，包括蛋白質折疊、細胞信號傳導、細胞凋亡和轉錄。它們通過直接結合和改變其靶蛋白的構象來發揮其功能，因此充當分子開關。

細菌slyD基因編碼FKBP型肽基-脯氨酰順反式異構酶（PPIase）。SlyD是細菌雙結構域蛋白，其充當分子伴侶、脯氨酰順/反式異構酶和鎳結合蛋白。位于SlyD的一個結構域中的蛋白伴侶功能涉及雙精氨酸易位，并且使蛋白質折疊中的脯氨酰順/反式異構酶結構域的催化效率增加兩個數量級。

Schlapschy和Skerra（于：Periplasmic chaperones used to enhancefunctional secretion of proteins in E. coli. Methods Mol Biol. 2011；705:211-24）公開了給予重組基因產物的折疊以及蛋白質聚集（即包涵體形成）的問題在大腸桿菌（Escherichia coli）中經常遇到。對于攜帶結構二硫鍵的蛋白質尤其如此，所述蛋白質包括抗體片段、細胞因子、生長因子和真核細胞表面受體的細胞外片段。因此，他們開發了輔助質粒pTUM4，其影響四種已建立的周質蛋白伴侶和/或折疊催化劑的過表達：硫醇-二硫化物氧化還原酶DsbA和DsbC，其催化二硫鍵的形成和異構化，以及具有蛋白伴侶活性的兩個肽基-脯氨酰順/反式異構酶，FkpA和SurA。