[發明專利]酵母細胞

有效

• 申請號: 201680081026.0
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN108603213B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: T.沃格;A.戈利埃德
• 申請（專利權）人: 合成生物制品有限責任公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝;易方方

本發明涉及一種Komagataella屬酵母細胞，所述細胞包含可通過解阻遏誘導的甲基營養型酵母細胞的直系同源啟動子或其變體，其中所述直系同源啟動子是甲基營養型酵母細胞的直系同源甲酸脫氫酶(FMD)啟動子。

本發明涉及在酵母細胞中的直系同源啟動子的用途。

諸如生物藥物或工業相關生物催化劑的重組蛋白最常通過在微生物中進行異源基因表達的方式生產。經常使用大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和絲狀真菌并長期將其用于重組蛋白的生產。在過去二十年中，甲基營養型酵母Komagataella(Pichia)pastoris、Komagataella(Pichia)phaffii(Pp)、KomagataellaKurtzmanii、Ogataea(Hansenula)polymorpha(Hp)、Candida boidinii(Cb)和Ogataea(Pichia)methanolica(Pm)已成為有效的替代生產菌株。這些菌株使高細胞密度的異源蛋白實現高速表達成為可能。在上述四個酵母物種中，P.pastoris(Komagataella phaffii)在此期間最長用于異源蛋白生產。

所有甲基營養型酵母均具有嚴格調控的強啟動子，其參與甲醇利用(MUT)基因表達的調控。甲醇利用基因的啟動子通常在存在抑制碳源(如葡萄糖)時被抑制，并且在存在甲醇作為碳源時極大地上調。如果抑制碳源被耗竭或在存在非抑制性碳源的條件下，則所述啟動子通過解阻遏被活化，因此這種作用的強度在物種之間以及甚至在同一生物體內可能變化極大。例如，與甲醇誘導條件相比，在解阻遏條件下，在P.pastoris GS115(PPpAOX1)中醇氧化酶-1基因的啟動子僅具有2-4％的活性。而與此相反的是，與甲醇誘導條件相比，在解阻遏條件下，在H.polymorpha(PHpMOX)中直系同源物基因(甲醇氧化酶，MOX)的啟動子具有高達70％的活性。而且在C.boidinii(醇氧化酶1，AOD1)和P.methanolica(甲醇氧化酶1/2，MOD1/2)中的直系同源物基因的啟動子也具有類似的行為。

出于操作安全性方面的原因，特別是在大規模工業生產中使用具有毒性和可燃性的甲醇誘導表達的不利的，因此強解阻遏啟動子構成了有利的替代方案。因此，最近開發了具有不同解阻遏性質的PPpAOX1變體、替代啟動子和新型MUT啟動子，以使得能夠在工業生產規模上實現無甲醇蛋白表達。由于與甲醇誘導的啟動子相比，此類啟動子的表達速率通常低很多，因而本發明的一個目的是提供重組蛋白在酵母(如P.pastoris)中可誘導的和無甲醇強過表達替代的可能性。

使用Komagataella屬酵母細胞實現了這一目的，所述細胞包含可通過解阻遏誘導的甲基營養型酵母細胞的直系同源啟動子或其變體，其中所述直系同源啟動子是甲基營養型酵母細胞的直系同源甲酸脫氫酶(FMD)或甲醇氧化酶(MOX)啟動子；在這一過程中，在甲基營養型酵母細胞中的直系同源啟動子能夠在解阻遏條件下控制多肽的表達。

使用Komagataella(Pichia)屬酵母細胞也實現了這一目的，所述細胞包含甲基營養型酵母細胞的直系同源甲酸脫氫酶(FMD)啟動子和/或甲醇氧化酶(MOX)啟動子或者這兩種啟動子的變體，其中在Komagataella屬酵母細胞中直系同源啟動子的原始調控性質被保留。

令人驚訝地發現，在其他甲基營養型酵母細胞中也具有能夠在解阻遏條件下控制多肽表達的啟動子，其優選地不屬于Komagataella(Pichia)屬，能夠在解阻遏條件下控制多肽的表達(例如，與非解阻遏條件相比表達增加)，其也具有與在Komagataella(Pichia)屬酵母細胞中相似的性質。