[發明專利]靶核酸的等溫環介導擴增(LAMP)的熒光檢測的方法，寡核苷酸及其試劑盒

在審

• 申請號: 201680074861.1
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN108431235A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 久利亞·米奴茨;里卡爾多·麥斯特里尼
• 申請（專利權）人: 索靈股份公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6853;C12N15/11
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;沈敬亭

本發明涉及基于熒光共振能量轉移(FRET)機制的用于檢測靶核酸序列的等溫環介導(LAMP)擴增的方法。本發明還涉及適用于實施本發明的LAMP?FRET方法的寡核苷酸的組和試劑盒。

技術領域

本發明涉及通過環介導等溫擴增(LAMP)檢測核酸擴增的方法，以及用于進行本發明方法的一組寡核苷酸和試劑盒。

背景技術

環介導等溫擴增(LAMP)是最近開發的經由自動循環鏈置換反應的核酸擴增方法，其通常在60℃至65℃的恒定溫度下進行(Notomi T.et al2000.Nucleic acidsRes.Vol.28(12)-e63)。這種技術采用具有鏈置換活性的DNA聚合酶和一組四個寡核苷酸，稱為內部和外部引物，其專門設計為識別靶核酸上的六個不同的識別位點。兩個外部引物僅在非循環步驟期間在鏈置換中發揮作用，而內部引物同時包括正義和反義序列并幫助形成具有莖環結構的典型LAMP擴增產物。

除了四種寡核苷酸引物之外，LAMP測定還可以涉及使用兩種另外的引物，即所謂的環引物，以提高擴增效率，由此得到每個靶序列共六個引物。跨越靶核酸上的八個不同序列的不同引物的這種組合提供了顯著程度的測定特異性。

基于LAMP的技術具有靈敏度高，擴增快和操作簡單的優點。LAMP測定導致擴增產物的高效合成，其比相同體積中通過經典PCR反應獲得的高至少50倍。另外，在等溫條件下擴增核酸的能力使得能夠使用簡單且有成本效益的設備，而不需要熱循環。在LAMP測定中，特異性擴增子的擴增和檢測可以在一個步驟中完成，從而與標準RT-PCR相比顯著減少了反應時間。

已經采用了幾種方法檢測LAMP擴增產物，包括沉淀的焦磷酸鎂的目測或濁度監測(Tomita N.,et al.2008.Nat.Protoc.3:877-882；Mori Y.,etal.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154)，采用插入熒光團的雙鏈DNA(dsDNA)的熒光檢測(Zhang X,et al.2013,PLoS One8(12):e82841；Mair G.et al.2013,BMC Veterinary Research 9:108.)，通過焦磷酸鹽轉化報道的生物發光(Gandelman OA.,et al.2010,PLoS One 5(11):e14155)。

用于間接檢測LAMP擴增的已知策略主要依賴于作為反應副產物的焦磷酸鹽的形成。隨著LAMP反應進行，焦磷酸根離子通過在核酸聚合期間脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)引入DNA鏈中而釋放，而這些離子與存在于反應混合物中的二價金屬離子，特別是鎂離子反應而產生白色不溶性焦磷酸鎂沉淀(Mori Y.,et al.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154)。這種產物導致反應溶液的濁度逐漸增加，并且焦磷酸鹽沉淀物可以在濁度方面定量測量，或通過離心后通過肉眼觀察為顆粒。在可選的方式中，LAMP擴增的檢測通過在反應中引入錳離子和鈣黃綠素實現。鈣黃綠素的熒光通過結合錳離子而自然淬滅。作為LAMP反應的副產物的焦磷酸鹽生成通過沉淀從緩沖液中去除錳離子，而與恢復的鈣黃綠素熒光相關聯的濁度增加使得能夠在用可見光或UV光激發時容易地目視讀取(Tomita N.,etal.2008.Nat.Protoc.3:877-882)。在又一種檢測方式中，通過由熱穩定的螢火蟲熒光素酶產生的生物發光監測在DNA合成期間產生的焦磷酸向ATP中的酶促轉化(Gandelman OA.,etal.2010,PLoS One5(11):e14155)。