[發(fā)明專利]靶核酸的等溫環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)的熒光檢測的方法，寡核苷酸及其試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201680074861.1 | 申請日： | 2016-12-19 |
| 公開（公告）號： | CN108431235A | 公開（公告）日： | 2018-08-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 久利亞·米奴茨;里卡爾多·麥斯特里尼 | 申請（專利權(quán)）人： | 索靈股份公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6844 | 分類號： | C12Q1/6844;C12Q1/6853;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240 | 代理人： | 張英;沈敬亭 |
| 地址： | 意大利*** | 國省代碼： | 意大利;IT |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 寡核苷酸 試劑盒 介導(dǎo) 擴增 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 靶核酸序列 熒光檢測 靶核酸 檢測 | ||
1.一種檢測靶核酸序列的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的方法，所述方法包括以下步驟：
i)使可能含有所述核酸靶序列的測試樣品與具有鏈置換活性的DNA聚合酶和由以下組成的寡核苷酸的組接觸：
a.第一外部引物F3和第二外部引物B3；
b.第一內(nèi)部引物FIP和第二內(nèi)部引物BIP，
其中FIP由3’核酸序列F2和5’核酸序列F1c組成，且BIP由3’核酸序列B2和5’核酸序列B1c組成，
其中F2與所述靶核酸序列的F2c區(qū)互補，且B2與所述靶核酸序列的B2c區(qū)互補，
其中F2c和B2c是位于所述靶核酸序列的相反鏈上的非重疊區(qū)域；
c.第一環(huán)引物L(fēng)F和可選的第二環(huán)引物L(fēng)B，其能夠與所述靶核酸序列的各自的區(qū)域雜交，
其中如果存在，所述環(huán)引物L(fēng)F或所述環(huán)引物L(fēng)B在其5'-末端由至少一個受體熒光團標(biāo)記；
d.一個核酸探針，其能夠在標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物的5'的位置處與所述靶核酸序列雜交，使得當(dāng)所述核酸探針與所述靶核酸序列雜交時，使所述核酸探針的3′-末端緊鄰所述標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物的5'-末端，
其中所述核酸探針在其3'-末端用能夠?qū)⒓ぐl(fā)能量轉(zhuǎn)移到所述LF或LB環(huán)引物的至少一個受體熒光團的至少一個供體熒光團標(biāo)記，并且其中在吸收供體熒光團激發(fā)能量時，所述受體熒光團的熒光發(fā)射的強度增加；以及
ii)檢測作為所述靶核酸序列的LAMP擴增的指示的熒光參數(shù)的變化，其中所述熒光參數(shù)的變化是所述受體熒光團的熒光發(fā)射的強度的增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)與所述靶核酸序列雜交時，所述核酸探針的所述3'-末端與所述標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物的所述5'-末端間隔不大于6個核苷酸，優(yōu)選地不大于1個核苷酸，更優(yōu)選0個核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物是莖環(huán)可延伸引物，包含i)能夠選擇性識別并雜交至所述靶核酸序列的各自的區(qū)域的中央環(huán)序列，和ii)彼此互補使得形成雙鏈莖的5'末端序列和3'末端序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述靶核酸序列包含優(yōu)選選自點突變、缺失、插入或易位的至少一個突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述靶核酸序列的擴增是所述至少一個突變的存在或不存在的指示。
6.一種用于檢測靶核酸序列的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的寡核苷酸的組，所述組由以下組成：
a.第一外部引物F3和第二外部引物B3；
b.第一內(nèi)部引物FIP和第二內(nèi)部引物BIP，
其中FIP由3'核酸序列F2和5'核酸序列F1c組成，且BIP由3'核酸序列B2和5'核酸序列B1c組成，
其中F2與所述靶核酸序列的F2c區(qū)互補，且B2與所述靶核酸序列的B2c區(qū)互補，
其中F2c和B2c是位于所述靶核酸序列的相反鏈上的非重疊區(qū)域；
c.第一環(huán)引物L(fēng)F和可選的第二環(huán)引物L(fēng)B，其能夠與所述靶核酸序列的各自的區(qū)域雜交，
其中如果存在，所述LF環(huán)引物或所述LB環(huán)引物在其5'-末端由至少一個受體熒光團標(biāo)記；
d.一個核酸探針，其能夠在標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物的5'的位置處與所述靶核酸序列雜交，使得在所述核酸探針與所述靶核酸序列雜交時，所述核酸探針的3'-末端緊鄰所述標(biāo)記的LF或LB環(huán)引物的5'-末端，其中所述核酸探針在其3'-末端用能夠?qū)⒓ぐl(fā)能量轉(zhuǎn)移到所述LF或LB環(huán)引物的至少一個受體熒光團的至少一個供體熒光團標(biāo)記，并且其中所述受體熒光團的熒光發(fā)射的強度在吸收供體熒光團激發(fā)能量時增加。
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