[發(fā)明專(zhuān)利]牛血清組合物和使用所述牛血清組合物作為添加劑培養(yǎng)細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680066959.2
• 申請(qǐng)日: 2016-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108291202A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 山原研一;須藤薰雄;須藤稔太;廣島友治
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山原研一
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/078
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/078;C12N5/077;A61K35/19;A61K35/16;A61K35/17
• 代理公司: 中國(guó)專(zhuān)利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 王媛媛;萬(wàn)雪松

提供了經(jīng)濟(jì)的包含許多可用于細(xì)胞增殖的因子的牛血清組合物的制備方法。其包括用抗凝劑進(jìn)行牛全血的抗凝處理的步驟，從抗凝全血獲得白膜層和比重比白膜層比重大的級(jí)分的步驟，和在給定的溫度下促進(jìn)和激活所得白細(xì)胞和血小板之間的相互作用達(dá)不少于給定的時(shí)間以引起從白細(xì)胞和/或血小板中分泌或釋放體液因子，和用再凝固劑進(jìn)行包含體液因子的血液組分的再凝固處理的步驟。

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及牛血清組合物和通過(guò)使用所述牛血清組合物作為添加劑培養(yǎng)細(xì)胞的方法。

[背景技術(shù)]

已知向培養(yǎng)基中加入牛血清對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的增殖是有效的。特別地，胎牛血清含有許多包括生長(zhǎng)因子在內(nèi)的體液因子，并已成為細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)。

然而，由于牛海綿狀腦病(BSE)的問(wèn)題，在大洋洲(除了發(fā)生BSE的那些國(guó)家之外的國(guó)家)生產(chǎn)的胎牛血清被廣泛使用，因此導(dǎo)致價(jià)格飛漲。盡管不是來(lái)源于胎兒的成年牛血清也可以用于細(xì)胞培養(yǎng)，但已知成年牛血清不像胎牛血清那樣含有那么多包括生長(zhǎng)因子在內(nèi)的體液因子。

另一方面，據(jù)報(bào)道，加入富血小板血漿(PRP)的培養(yǎng)基可用于細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖，所述富血小板血漿(PRP)通過(guò)在抗凝處理后對(duì)人全血進(jìn)行離心等將血小板濃縮至高濃度制備(非專(zhuān)利文件1)。

富血小板血漿含有大量的血小板衍生的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子-BB (PDGF-BB)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等，其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖(非專(zhuān)利文件2)。

除了上述生長(zhǎng)因子之外，血小板還含有稱(chēng)為血小板因子4 (PF4)的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，并誘導(dǎo)白細(xì)胞的活化 (非專(zhuān)利文件3)。

除了血小板之外，全血中含有的血細(xì)胞組分還包含白細(xì)胞。白細(xì)胞分泌血小板活化因子(PAF)以及白細(xì)胞介素、干擾素和集落刺激因子，并且已知PAF活化血小板(非專(zhuān)利文件4)。

通過(guò)靜置、簡(jiǎn)單離心處理等方法從抗凝人全血中獲得白膜層。就人而言，由于白膜層的比重與血漿和紅細(xì)胞的比重明顯不同，所以它是一種含有高濃度血小板以及高濃度白細(xì)胞的白色層。因此，其中白膜層內(nèi)的血小板和白細(xì)胞相互活化并且大量包含各種體液因子包括由上述血小板和白細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子、趨化因子、活化因子等的血清被認(rèn)為適用于細(xì)胞培養(yǎng)。

然而，就牛而言，如下所述，紅細(xì)胞的比重比人紅細(xì)胞比重小，并且白細(xì)胞的比重和紅細(xì)胞的比重部分重疊。結(jié)果，白膜層含有較少的白細(xì)胞并形成模糊層。因此，為了回收白細(xì)胞和血小板二者，還必須收獲比重比白膜層比重大的級(jí)分(就牛而言=含有白細(xì)胞的級(jí)分)，如本發(fā)明所闡明的。

近年來(lái)，已期望將細(xì)胞制劑作為再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的治療應(yīng)用。另一方面，已報(bào)道了靜脈內(nèi)施用例如通常不存在的細(xì)胞誘導(dǎo)血液凝固(非專(zhuān)利文件5)。因此，實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)很重要的是建立不太可能誘導(dǎo)血液凝固的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

專(zhuān)利文件1描述了含有凝固臍帶血的液體組分的增殖刺激劑。所述刺激劑促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。在專(zhuān)利文件1中，向未凝固的臍帶血中添加紅細(xì)胞沉降劑，以將血液分離為含有紅細(xì)胞的級(jí)分和上清液級(jí)分。將上清液級(jí)分分離成含有造血干細(xì)胞的沉淀級(jí)分和含有血小板的液體級(jí)分。然后，使含有血小板的液體級(jí)分與玻璃珠接觸以產(chǎn)生增殖刺激劑。也就是說(shuō)，增殖刺激劑不含有其中存在白細(xì)胞和造血干細(xì)胞的沉淀級(jí)分。另一方面，如下所述，本發(fā)明提供了血清組分，其通過(guò)下列方式獲得：在給定溫度下激活白膜層中白細(xì)胞和血小板的相互作用達(dá)不少于給定的時(shí)間，并進(jìn)行包含所得體液組分的血液組分的再凝固處理。因此，本發(fā)明與專(zhuān)利文件1中描述的發(fā)明完全不同。

專(zhuān)利文件2描述了一種通過(guò)從含有抗凝劑的血液中除去富血小板血漿和材料組分并將由玻璃材料組成的吸附部件供給到所得血漿中以通過(guò)吸附除去血漿中的纖維蛋白原從而分離血清的方法。在專(zhuān)利文件2中，利用纖維蛋白原附著于玻璃材料的表面，使用玻璃材料作為吸附材料以除去血漿中的纖維蛋白原。在本發(fā)明中，如下所述，加入玻璃材料以進(jìn)一步激活白膜層中白細(xì)胞和血小板的相互作用。因此，本發(fā)明與專(zhuān)利文件2中描述的發(fā)明完全不同。