[發明專利]稀有細胞的無離心機分離和檢測

在審

• 申請號: 201680065223.3
• 申請日: 2016-09-22
• 公開（公告）號: CN108351347A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 卡格里·A·沙夫倫;張君禮;黃萬鋒
• 申請（專利權）人: 普渡研究基金會
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/543;G01N33/551;G01N33/569
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

公開了用于分離流體樣品中的目標實體的添加性的技術，包括直接稀釋方法和直接孵育方法。在一些實施方式中，將一定體積的稀釋劑加入到流體樣品中以產生第一混合物。加入的稀釋劑的體積可以足以獲得低于所述流體樣品的粘度的特定粘度的第一混合物。向所述第一混合物中加入大量綴合有結合部分的磁珠以產生第二混合物。將所述第二混合物孵育一段時間，該時間足以使所述綴合有結合部分的磁珠結合所述第二混合物中的稀有目標實體。將所述第二混合物的一部分注入流體室。施加磁力以將所述第二混合物中的磁化稀有目標實體吸引到所述流體室內的分離表面。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2015年9月22日提交的名稱為“來自全血的細胞的無離心機分離和檢測的方法(METHOD FOR CENTRIFUGE-FREE ISOLATION AND DETECTION OF CELLS FROMWHOLE BLOOD)”的美國臨時專利申請第62/222,193號的權益，將其通過引用整體并入本文。

技術領域

本申請涉及分離生物流體樣品中的目標顆粒(如細胞)的方法。

背景技術

存在于流體樣品(如體液，例如全血)中的目標實體(如細胞)的分離、檢測和/或捕獲是非常重要的，因為捕獲的細胞可能是病理狀況或疾病的指征。可以列舉細胞與疾病狀態的相關性，對細胞進行遺傳分析或培養并用于測試藥物組合或發現新藥物。特別地，體液如血液中稀有細胞的分離和檢測是尤其重要的，但由于流體樣品中此類稀有細胞的數量非常低，所以它們的分離和檢測很難。

患者血液中的循環腫瘤細胞(或CTC)以及母體血液中的胎兒細胞(包括胎兒有核紅細胞、胎兒白細胞和胎兒滋養層細胞)是此類稀有細胞的實例。大多數癌癥相關的死亡是由于腫瘤細胞轉移到可能遠離原發性腫瘤的各種其它組織和器官結構。CTC可以從原發性和轉移性腫瘤脫離并進入血管系統。CTC的早期檢測可以在提高存活率中發揮重要作用。

CTC的檢測可以進一步用于確定治療例如化療、放射、手術等的功效。在此類治療之后存在CTC可指示癌癥的復發。CTC和其它稀有細胞可指示稀有事件，并且掌握大量未解的生物學和醫學問題的關鍵。在檢測和記數之后，也可以對稀有細胞進行進一步的下游測試和分析。例如，可以將它們引入(例如，通過移植)到動物中以研究轉移模型以及對它們進行測序以查詢可以揭示突變的基因組和轉錄組并定量基因表達。此外，有可能培養CTC、使CTC生長，以及用于理解轉移生物學以及藥物測試，為個性化醫療鋪平道路。

用于CTC和其它稀有細胞以及甚至其它通常不被認為是稀有的細胞的傳統提取技術通常包括，基于與全血中的每種成分相關的質量，使用離心或其它消減技術，將紅細胞(RBC)與其它類似大小的細胞如白細胞(WBC)和CTC分開，以及將血漿分成不同的層。此類技術通常假定血漿大部分沒有細胞，因此去除血漿以防止非特異性結合。通常使用抽吸器施加負壓以從已離心的樣品容器吸出血漿來去除血漿。

由于CTC和其它稀有細胞的濃度通常低至1個細胞/毫升全血，所以在小體積的全血中檢測所述CTC和其它稀有細胞通常具有挑戰性。因此，使用離心去除血漿的提取方案通常需要大量的全血以捕獲和提取足夠數量的待分析和/或收獲的CTC。對CTC細胞的可靠分析通常需要從樣品中提取幾百個CTC，所述樣品包括幾乎數以千萬的WBC和數億個RBCS。因此，使用較小的樣品量通常難以檢測和量化CTC。

包括離心(和其它消減技術)的樣品處理通常會在檢測和收集全血中的CTC和其它稀有細胞中引起另外的并發癥，因為CTC可能無意中保留在與離心樣品體積的其它細胞組分接觸的血漿的底部區域。例如，在抽吸血漿時，可能會丟失CTC，在離心完成后，降低CTC的整體捕獲效率。然而，對于體液中濃度較高的其它類型的細胞，通常不是這種情況。因此，當利用消減技術分離細胞組分時，從較小樣品體積的全血中高產量地連續提取CTC和其它稀有細胞通常難以實現。

發明概述