[發(fā)明專利]分子克隆提取和驗證方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680063982.6
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號: CN108603191A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設計）人: 柳兌勛;金孝基;韓孝俊;權圣勛
• 申請（專利權）人: 塞勒密斯株式會社;首爾大學校產學協(xié)力團
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6869;G01N33/68;C40B40/08;C40B40/06
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成;肖軼

本發(fā)明提供了一種提取和表征分子克隆的方法。所述方法包括：提供其上形成有分子克隆的基板；以非接觸的方式對所述分子克隆中所需要的那些施加能量并從所述基板上提取所需要的分子克隆；將DNA條形碼與所提取的分子克隆的堿基序列化學連接；并通過平行測序分析技術分析DNA條形碼所連接的堿基序列。

技術領域

本公開涉及提取和表征分子克隆的方法。

背景技術

抗體是由抗原(例如，病毒和細菌)刺激體內免疫應答而產生的糖蛋白，其特異性結合抗原以誘導細胞外刺激。抗體以高選擇性與特定蛋白結合。由于這個原因，抗體在生物學、生物技術和醫(yī)學領域具有很高的實用性，包括從與目標蛋白標記/觀察相關的基礎研究到與患者體內異常蛋白活性調節(jié)有關的醫(yī)學應用。特別是，抗體作為抗體藥物綴合物(ADC)和嵌合抗原受體-T細胞(CART)治療劑等下一代新藥物平臺的應用在近來的新藥物開發(fā)中不斷增加。

一般而言，抗體的有用性取決于它們與靶蛋白結合的能力和特異性。在此，特異性是指抗體結合靶蛋白但不結合其他蛋白的性質。這種結合性質來自抗體的三級結構特征。抗體的三級結構根據抗體的氨基酸序列的變化而改變。通過改變與抗體的特定氨基酸殘基對應的脫氧核糖核酸(DNA)序列來修飾抗體的三級結構，和對結構修飾的抗體的表征是抗體工程領域中廣泛使用的方法學。這些方法需要對抗體進行測序的技術和選擇具有特定序列的DNA分子的技術，這些分子在抗體開發(fā)的整個過程中占據非常重要的位置。

通常，通過克隆和Sanger測序來完成抗體的測序和對所需抗體的DNA的選擇。但是，它們非常耗費成本和時間，使得難以開發(fā)抗體。為了解決這些問題，已經提出了基于下一代測序(NGS)的方法。但是，這些方法只能分析短序列，這限制了它們的實際應用。本發(fā)明人進行了研究以克服上述技術限制并以低成本對抗體進行測序。因此，本發(fā)明人提出了快速提取分子克隆并在使用分子克隆之前基于DNA條形碼和下一代測序(NGS)對分子克隆進行測序的方法。

發(fā)明內容

解決問題的方法

本公開提供了用于表征單獨分離的分子克隆的方法和系統(tǒng)。傳統(tǒng)上，Sanger測序被用作分子克隆測序的工具。近年來，下一代測序已被用于生物學、生物技術和相關領域以及各行各業(yè)的各種應用。然而，從經濟角度來看，分子克隆的下一代測序的有效性并不令人滿意。

根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種提取和表征分子克隆的方法，所述方法包括：提供其上形成有分子克隆的基板；對所述分子克隆中所需要的那些分子克隆以非接觸的方式施加能量從而從所述基板上提取所需要的分子克隆；將DNA條形碼與所提取的分子克隆的序列化學連接；并通過平行測序確定DNA條形碼連接的序列。

對所需要的分子克隆的非接觸提取使得能夠快速提取分子克隆，并且不要求使用耗材，因此可以使提取成本最小化。另外，具有已知序列的DNA條形碼與分子克隆的接附提供了關于相應分子克隆位置的信息，使得能夠通過下一代測序對分子克隆進行測序。根據本公開的方法，可以使用下一代測序替代Sanger測序，從而能夠以大幅降低的成本大規(guī)模快速分析分子克隆。因此，本公開的方法使得能夠以低成本合成DNA核苷酸，并因此預期有助基因合成領域的技術發(fā)展。

附圖說明

圖1是示出根據本公開的一個實施方式的提取和表征分子克隆的方法的流程圖。

圖2是示出根據本公開的一個實施方式的分子克隆提取和分析方法的示意過程流程圖。

圖3顯示根據本公開的一個實施方式的emPCR產物的圖。

圖4顯示根據本公開的一個實施方式的分子克隆的形狀和布置。

圖5和6是根據本公開的一個實施方式的分子克隆提取系統(tǒng)的示意圖。

圖7示出根據本公開的示例性實施方式的提取分子克隆的各種過程的示意圖。