[發明專利]DNA寡核苷酸的多對組裝

在審

• 申請號: 201680055052.6
• 申請日: 2016-10-01
• 公開（公告）號: CN108026137A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: M·J·拉喬伊;J·C·克萊因;J·J·施瓦茲;D·貝克;J·A·森迪萊;L·J·斯圖爾特
• 申請（專利權）人: 華盛頓大學
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00;C07H21/02;C07H21/04;C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 北京市中倫律師事務所 11410
• 代理人: 楊黎峰;鐘錦舜

本發明提供了用于多重組裝寡核苷酸的方法。

交叉引用

本申請涉及2015年10月1日提交的美國臨時專利申請序列號62/235,974，其公開內容通過引用整體并入本文。

關于聯邦資助研究的說明

本發明是在美國政府的能源部門-勞倫斯伯克利國家實驗室-聯合基因組研究所獎金號DE-AC02-05CH11231和國立衛生研究院(NIH)獎金號1R21CA160080下進行的。美國政府對本發明享有一定的權利。

序列表

在此提交的標題為“16-1242-PCT_SequenceListing_ST25.txt”和大小為7kb的序列表通過引用整體并入。

背景技術

傳統上，DNA已經通過固相亞磷酰胺化學合成。基于柱的合成產生多達200元(mer)，差錯率約為每200個核苷酸1個，且每個產物的收率為10至100nmol。基于柱的DNA合成受限于對384-孔板的通量，并且寡核苷酸取決于長度和收率花費0.05美元至1.00美元/堿基對(bp)。用亞磷酰胺化學(例如Agilent)和基于半導體的電化學酸生產陣列(例如CustomArray)而進行的基于噴墨的核苷酸印刷的商業化，具有增加的通量并降低了寡核苷酸合成的成本。這些寡核苷酸的成本范圍取決于長度、規模和平臺為0.00001-0.001美元/bp。然而，這些平臺受限于合成長度短、合成誤差率高、收率低以及從復雜庫中組裝長構建體的挑戰。

近來，許多方法解決了陣列合成的寡核苷酸的高錯誤率，具有成本和保真度之間的折衷。低成本的方法包括蛋白質，例如MutS、聚合酶和其它結合和切割(cleavage)異源雙鏈體的蛋白質。然而，由于這些方法依賴于識別錯配并且要求大部分序列相同，所以它們并不總是與復雜庫相容，因此必須在單個基因組裝之后進行。此外，由于這些方法保持錯誤率高達每1000個核苷酸1個，因此需要進一步篩選以確認正確的序列。諸如撥出(Dial-Out)PCR的最近的方法依賴于DNA測序，然后檢索序列驗證的構建體，實現錯誤率低至10-7。雖然這些方法可以用于復雜的寡核苷酸池，并且產生非常低的錯誤率，但是這些方法成本高、時間密集且不總是能回收目標分子。

盡管它們的誤差率高，但從微陣列切割的廉價寡核苷酸池最近能夠對啟動子和增強子功能進行高通量分析，為這些調控元件的詞匯提供了新的見解。它們也被用于破譯遺傳變異體在蛋白質功能中的作用。然而，這些研究都受到合成長度短的限制-CustomArray為約160bp，Agilent為約230bp。

合成長度短和錯誤率高對使用陣列衍生的寡核苷酸用于功能測定和基因組裝表現出瓶頸。本文描述了將數千個陣列衍生的寡核苷酸組裝成接近順式調控元件和蛋白結構域的長度估計值的靶標的方法。與現有方法相比，這里描述的方法不限制使用限制性酶的序列空間，具有高通量，并且提供檢索無錯組裝的有效方法。

發明內容

在第一方面，本發明提供了用于組裝一個或多個雙鏈多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)擴增第一多個單鏈重疊寡核苷酸，其中所述第一多個單鏈重疊寡核苷酸包含：(i)能夠退火以產生一個或多個雙鏈多核苷酸的具有同源性的重疊區域，和(ii)每個單鏈重疊寡核苷酸中的至少一個共同引物結合位點；(b)組裝一個或多個雙鏈多核苷酸，其中所述組裝包括變性、退火和延伸所述第一多個單鏈重疊寡核苷酸以產生一個或多個雙鏈多核苷酸。