[發(fā)明專利]DNA寡核苷酸的多對(duì)組裝

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680055052.6
• 申請(qǐng)日: 2016-10-01
• 公開（公告）號(hào): CN108026137A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·J·拉喬伊;J·C·克萊因;J·J·施瓦茲;D·貝克;J·A·森迪萊;L·J·斯圖爾特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華盛頓大學(xué)
• 主分類號(hào): C07H21/00
• 分類號(hào): C07H21/00;C07H21/02;C07H21/04;C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 北京市中倫律師事務(wù)所 11410
• 代理人: 楊黎峰;鐘錦舜

1.一種用于組裝一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)擴(kuò)增第一多個(gè)單鏈重疊寡核苷酸，其中，所述第一多個(gè)單鏈重疊寡核苷酸包含：

(i)能夠退火以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的具有同源性的重疊區(qū)域，和

(ii)每個(gè)單鏈重疊寡核苷酸中的至少一個(gè)共同引物結(jié)合位點(diǎn)；

(b)組裝一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸，其中，所述組裝包括變性、退火和延伸所述第一多個(gè)單鏈重疊寡核苷酸以產(chǎn)生所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括：

(c)標(biāo)記所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸，其中，所述標(biāo)記包括使用一對(duì)標(biāo)記引物擴(kuò)增所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈寡核苷酸以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的雙鏈多核苷酸，其中，該對(duì)標(biāo)記引物中的每個(gè)標(biāo)記引物包含：

(i)包含獨(dú)特側(cè)翼序列的第一區(qū)段，和

(ii)包含種子序列的第二區(qū)段；

(d)對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的雙鏈多核苷酸進(jìn)行測(cè)序，其中，所述測(cè)序包括將所述種子序列結(jié)合到測(cè)序平臺(tái)并進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)以鑒定一個(gè)或多個(gè)序列驗(yàn)證的多核苷酸；以及

(e)檢索所述一個(gè)或多個(gè)序列驗(yàn)證的多核苷酸，其中，所述檢索包括將互補(bǔ)引物與所述一個(gè)或多個(gè)序列驗(yàn)證的多核苷酸中的至少一個(gè)標(biāo)記引物的第一區(qū)段堿基配對(duì)，并且在合適條件和合適試劑的存在下，擴(kuò)增序列驗(yàn)證的多核苷酸以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)驗(yàn)證的多核苷酸；或

(c)功能性多肽的表型選擇，其中，所述表型選擇包括酵母展示、噬菌體展示、mRNA展示、核糖體展示、哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示、細(xì)菌細(xì)胞展示、基于乳液的蛋白質(zhì)選擇、一部分基因組的功能互補(bǔ)、或多肽進(jìn)化領(lǐng)域的專家已知的其它選擇方法。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸包含至少100、至少200、至少300、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750或至少2000個(gè)雙鏈多核苷酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包括將兩個(gè)或更多個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸逐步組裝成組裝的多核苷酸產(chǎn)物，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸具有能夠退火的具有同源性的重疊區(qū)域和每個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸中的至少一個(gè)共同引物結(jié)合位點(diǎn)；以及

(f)在適于退火具有同源性的重疊區(qū)域的條件和合適試劑的存在下，將兩個(gè)或更多個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸組合，所述試劑用于通過延伸雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸來(lái)組裝初始所需的多核苷酸產(chǎn)物以產(chǎn)生初始所需的多核苷酸產(chǎn)物；以及

(g)將初始所需的多核苷酸產(chǎn)物和下一個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸組合，其中初始所需的多核苷酸產(chǎn)物和下一個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸具有能夠退火的具有同源性的重疊區(qū)域和每個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸中的至少一個(gè)共同引物結(jié)合位點(diǎn)，并且在合適試劑的存在下組裝初始所需的多核苷酸產(chǎn)物和下一個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸，所述試劑用于通過延伸初始所需的多核苷酸產(chǎn)物和下一個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸來(lái)對(duì)組裝的多核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行組裝；以及

(h)反復(fù)地重復(fù)(g)以逐步將另外的下一個(gè)雙鏈或驗(yàn)證的多核苷酸添加至初始所需的多核苷酸產(chǎn)物以產(chǎn)生組裝的多核苷酸產(chǎn)物。