[發(fā)明專利]在具有經(jīng)改造的輸入/輸出的微生物宿主中人乳寡糖的產(chǎn)生

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680052611.8
• 申請(qǐng)日: 2016-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN108026556B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·詹尼溫;D·瓦滕伯格
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 科漢森母乳低聚糖股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/18
• 分類號(hào): C12P19/18
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;姜建成

本發(fā)明涉及用于在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生寡糖的方法，以及涉及所述方法中使用的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含至少一種重組的糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白使得能夠輸出寡糖。

背景技術(shù)

人乳被認(rèn)為是嬰兒發(fā)育的最佳飲食。它由脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、微量元素和復(fù)合碳水化合物混合物組成，所述復(fù)合碳水化合物混合物包括乳糖和約150種結(jié)構(gòu)不同的寡糖(人乳寡糖，HMO)。

通過化學(xué)方法或通過生物技術(shù)方法產(chǎn)生HMO的嘗試主要引起了普遍的關(guān)注，這是由于它們對(duì)嬰兒的胃腸道菌群發(fā)育的有益影響，因此提倡將它們用作營養(yǎng)添加劑。除了這些益生元特性，迄今為止可觀察到HMO的許多其他積極的作用，這擴(kuò)展了它們的應(yīng)用領(lǐng)域。

然而，大量的科學(xué)研究需要純的單一化合物，這幾乎不可實(shí)現(xiàn)。對(duì)于復(fù)合的游離中性和酸性寡糖而言尤其如此，對(duì)于所述寡糖而言仍缺少有競(jìng)爭(zhēng)力的大規(guī)模生產(chǎn)方法(例如，乳-N-四糖(Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-新四糖(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-巖藻戊糖I(Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-新巖藻戊糖I(Fuc(α1-2)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)(乳-N-唾液酰戊糖a(LST-a；Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc))。用于產(chǎn)生這些化合物的微生物的代謝改造代表了最有希望的方法，因?yàn)榛瘜W(xué)方法不能產(chǎn)生數(shù)噸規(guī)模的這些分子。

對(duì)于結(jié)構(gòu)上更簡(jiǎn)單的HMO(例如2’-巖藻基乳糖、3-巖藻基乳糖或3’-唾液酰乳糖)，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種發(fā)酵方法，這些方法主要使用經(jīng)代謝改造的大腸桿菌(Escherichia coli)菌株。

然而，大規(guī)模的量?jī)H可通過以下方式來實(shí)現(xiàn)：增加寡糖向細(xì)菌細(xì)胞外的輸出，因此(i)增加產(chǎn)率和(ii)允許從培養(yǎng)液中回收所需寡糖。解決輸出問題的需求似乎隨著所產(chǎn)生的糖的大小而增大。此外，使用目前可獲得的發(fā)酵方法，在產(chǎn)生更復(fù)雜的寡糖時(shí)，發(fā)生不想要的寡糖前體從生產(chǎn)細(xì)胞的輸出的問題，導(dǎo)致在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物和前體寡糖的不想要的混合。盡管已知多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜轉(zhuǎn)移單糖或二糖，但是幾乎不存在任何關(guān)于更大的寡糖(例如三糖和更大的寡糖)的轉(zhuǎn)運(yùn)的知識(shí)。

例如，通常使用的發(fā)酵模式生物大腸桿菌的基因組編碼多于500種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Busch and Saier,Crit Rev Biochem Mol Biol.2002；37(5):287-337)。這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類是非常不同的，并且亞組在易位(translocation)機(jī)制、蛋白結(jié)構(gòu)或進(jìn)化起源方面可不同。

典型的能量驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白逆著底物濃度或電化學(xué)梯度進(jìn)行底物移動(dòng)，而底物流經(jīng)通道的動(dòng)力學(xué)和方向主要遵循這樣的梯度。根據(jù)用于易位的能量來源，泵主要可分為初級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其分別利用代謝能量如ATP或電化學(xué)電勢(shì)(Davidson and Maloney,Trends Microbiol.2007Oct；15(10):448-55；Forrest et al,Biochim Biophys Acta.201 1Feb；1807(2):167-88)。盡管對(duì)于數(shù)種允許能量產(chǎn)生、碳水化合物輸入以及蛋白質(zhì)和抗菌物質(zhì)流出的膜蛋白獲得了深入的知識(shí)，然而迄今為止僅獲得了對(duì)少數(shù)所注釋的細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的機(jī)理過程或天然或可能底物的信息的敏銳的深刻了解。